A tiszai ingola (Eudontomyzon danfordi) első, mikroszkópikus parazita okozta megbetegedésének észlelése a Tisza vízgyűjtőjén

SOMOGYI Dóra^*1,2, NYESTE Krisztián¹, ANTAL László¹, VARGA Ádám³, SZÉKELY Csaba³, MOLNÁR Kálmán³, CECH Gábor³, SELLYEI Boglárka³

¹Debreceni Egyetem, Természettudományi és Technológiai Kar, Hidrobiológiai Tanszék, Debrecen
²Debreceni Egyetem, Juhász-Nagy Pál Doktori Iskola, Debrecen
³Agrártudományi Kutatóközpont, Állatorvos-tudományi Intézet, Halkórtan és parazitológia témacsoport, Budapest
^*s.dora9611[kukac]gmail.com

Kivonat

Bevezetés

Jelen álláspont szerint a Kárpát-medencében három ingolafaj (Petromyzontidae) előfordulásáról tudunk. A dunai ingola (Eudontomyzon mariae) a Duna, míg a Vladykov-ingola (Eudontomyzon vladykovi) a Duna és a Dráva vízrendszerében fordul elő, szemben a tiszai ingolával (Eudontomyzon danfordi), mely a Tisza vízrendszerének endemizmusa (Harka Á. és Sallai Z. 2004). Az ingolák életmódjáról (Kottelat M. and Freyhof J. 2007) és paraziták okozta megbetegedéseiről viszonylag keveset tudunk. Sobecka és munkatársai (2009) a dunai ingola 10 parazitájáról számoltak be, melyek mind a bélférgek közé sorolhatók, azonban eukarióta mikroorganizmusok okozta megbetegedésekről az ingolák (Cephalaspidomorphi) körében a mai napig nem rendelkezünk információkkal.

A dermocisztid paraziták okozta megbetegedések világszerte széles körben elterjedtek mind a gerinctelen, mind a gerinces szervezetekben, egyaránt beleértve a halakat, a kétéltűeket, a madarakat és az emlősöket (Mendoza et al. 2002, Glockling et al. 2013). A gombák és az állati egysejtűek evolúciós elválásának pontjával határos pozícióban elhelyezkedő Dermocystidium fajok a halak gyakori parazitái (Mendoza et al. 2002). Magyarországon korábban a sügér (Perca fluviatilis), az angolna (Anguilla anguilla), a ponty (Cyprinus carpio), valamint a széles kárász (Carassius carassius) esetében sikerült kimutatni Dermocystidium fajok okozta megbetegedéseket (Csaba G. és Láng M. 1991; Molnár K. 1979, Molnár K. és Sövényi J. 1984, Molnár et al. 2008), de egyre gyakrabban születnek publikációk az egyéb ős- és az idegenhonos halfajok ökológiai és gazdasági jelentőségű dermocisztidiózisairól Afrikában és Dél-Amerikában is (Eiras J.C. and Silva-Souza A.T. 2000, El-Mansy A. 2008, Fujimoto et al. 2017, Steckert et al. 2019).

Összességében elmondható, hogy bár a Dermocystidium fajok okozta megbetegedések széles körben elterjedtek az állatvilágban (így a halakban is), az ingolák dermocisztidiózisáról mindezidáig nem volt ismeretanyagunk. Jelen munkánkban elsőként számolunk be a tiszai ingola Dermocystidium-szerű parazitával való fertőzéséről.

Anyag és módszer

Terepi mintavétel:

Mintavételünket 2017. április 18-án egy egyedszámfelmérés keretén belül végeztük a Zempléni-hegységben található Kemence-patakon. A mintavétel során egy német gyártmányú Hans Grassl IG200/b típusú, akkumulátorról üzemelő, pulzáló egyenárammal működő halászgépet használtunk. Halászat közben lettünk figyelmesek az ingolák testét borító hólyagokra. Így a populáció méretének felmérése mellett a szóban forgó elváltozások populáción belüli elterjedtségét is feltérképeztük. Mivel az általunk felmért állomány közel 10%-án megfigyelhetők voltak ezen bőrelváltozások, a további vizsgálatok érdekében egy 16 cm-es (legalább 4 éves) egyedet hordozható akváriumban megvizsgáltunk, majd a gerincvelő elroncsolását követően testét a hossztengelyre merőlegesen két részre vágtuk. A test feji végét 70%-os etanolba, míg farki végét 10%-os pufferelt formalinba helyeztük. A minták begyűjtését és tárolását az Országos Környezetvédelmi, Természetvédelmi és Vízügyi Főfelügyelőség engedélyezte (engedélyszám: OKTF-KP/3460-27/2016).

Morfológiai és hisztológiai vizsgálatok:

Az ingola testét borító hólyagok morfológiai és szövettani vizsgálataira az Agrártudományi Kutatóközpont, Állatorvos-tudományi Intézet, Halkórtan és parazitológia témacsoport laboratóriumában került sor. A farki testfélről származó hólyagok egyikét fénymikroszkóp alatt feltártuk, az ürülő fehér, szemcsés váladékból készült kenetben spórákhoz hasonló képletek ezreit sikerült megfigyelnünk. A vizsgálat során egy, cellSens Entry képarchiváló szoftverrel felszerelt, Olympus BX53 kutatómikroszkóp segítségével fénymikroszkópos felvételeket is készítettünk. Az ingola 10%-os pufferelt formalinban tartósított részéből szövettani vizsgálatra egy 4–5 μm vastagságú metszetet készítettünk hematoxilin-eozin festéssel. A cisztákat határoló szövetek jellemzését Elliot D.G. (2011) irányelvei alapján végeztük.

Molekuláris biológiai vizsgálatok:

A parazita pontos rendszertani azonosítása érdekében molekuláris vizsgálatokat végeztünk. A hólyagból kinyert, majd 80%-os etanolban fixált spóraszerű képletekből genomiális DNS-t izoláltuk Geneaid™ DNS izoláló készlet (Geneaid Biotech Ltd., New Taipei City, Taiwan) segítségével. A 18S riboszómális DNS felsokszorosításához és szekvenálásához az alábbi primerpárt használtuk: AmgF 5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC; AmgR 5′-TATTGCCTCAAAC-TTCCAT) (González-Hernández et al. 2010). A PCR termék méretét és minőségét agarózgél-elektroforézissel ellenőriztük, majd a felsokszorosított DNS fragmentet EZ-10 Spin Column PCR Purification Kit segítségével tisztítottuk (Bio Basic Inc., Markham, Canada). A szekvenálás ABI BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit felhasználásával történt. A szekvenciák leolvasása, megrendelt szolgáltatás keretében, az ABI 3100 Genetic Analyser automata szekvenátorral zajlott. A nyers szekvenciákat a MEGA 6.06 szoftverrel ellenőriztük és szerkesztettük össze (Tamura et al. 2013). Szekvenciánkat a génbankban elérhető és ahhoz leginkább hasonló dermocisztid szekvenciákkal a CLUSTAL W szoftver segítségével illesztettük (Thompson et al. 1994). A filogenetikai rekonstrukció a maximum-likelihood algoritmus alapján történt (Akaike információs kritérium (AIC) modell). A filogenetikai fa megbízhatóságának becslésére bootstrap analízist végeztünk 1000‐szeres ismétlésben.

Eredmények és következtetések

A mintavétel során megvizsgált 274 tiszai ingola közül 25 egyeden figyeltük meg a bőr hólyagos elváltozásait. A faj fokozottan védett természetvédelmi státuszára való tekintettel egyetlen 16 cm-es egyedet gyűjtöttünk be további vizsgálatokra. A vizsgálatra gyűjtött ingola testének különböző részein összesen 10, kiboltosodó hólyagot (7–10 mm) észleltünk. A feltárásra került hólyagból ürülő fehér, szemcsés folyadékban, fénymikroszkóp alatt, apró (8–14 µm-es) spóraszerű képleteket figyelhettünk meg, melyek viszonylag vékony (0,5 µm) sejtfallal rendelkeztek. A képleten belüli teret túlnyomó részt szemcsés sejtállomány és keskeny citoplazma töltötte ki. Egyes esetekben a sejtfalhoz szorult sejtmagok is kirajzolódtak. A spóraszerű képleteken túl, a Dermocystidium fajokra gyakran jellemző spóraképző fonalak (hifa) képződését nem tapasztaltuk.

A molekuláris azonosítást célzó vizsgálatainkhoz a spóraszerű képletekből DNS-t izoláltunk, majd egy specifikus PCR reakció segítségével a 18S rDNS egy adott, 1348 bp hosszúságú szakaszát felerősítettük, és megszekvenáltuk. A génbankból az általunk vizsgált szekvenciához hasonló, összesen 39 Dermocystidium szekvenciát választottunk ki és illesztettünk egymásra, a végső illesztés 1411 bp hosszúságú lett. A tiszai ingola parazitája a spóraszerű képletekből nyert DNS vizsgálata alapján monofiletikus csoportot alkot több dermocisztid fajjal (pl. Dermocystidium salmonis, D. hylarum, Rhinosporidium seeberi, Valentines rwandae). Azonban a halak esetében ismeretes és a dermocisztid paraziták közül legjobban ismert Dermocystidium percae ezen csoporton kívül helyezkedik el. Az eredményeket tekintve elmondható, hogy a tiszai ingolából származó dermocisztid parazita a génbankból származó és azokkal összevetett szekvenciák közül a legnagyobb hasonlóságot a D. salmonis fajjal mutatta (98,4%), valamint az összes egyéb szekvenciától legalább 2% mértékben eltért.

Összefoglalás

Számos Dermocystidium parazita létezik világszerte, melyek édesvízi és anadrom vándorló halfajokon okoznak különféle megbetegedéseket (Feist et al. 2004, Zhang Q. and Wang Z. 2005, Molnár et al. 2008, Hassan et al. 2014, Mahboub H.H. and Shaheen A.A. 2020). A tiszai ingola a Kárpát-medence fokozottan védett endemizmusa, melynek parazitáiról mindezidáig nem rendelkeztünk információkkal. Jelen munkánk az első, amely adatokat közöl eukarióta mikroorganizmusok okozta megbetegedésekről az (édesvízi) ingola fajokban. Sőt, a tanulmányozásra került Dermocystidium-szerű kórokozó a tiszai ingola tudomány által első felismert parazitája.

Az általunk begyűjtött és további vizsgálatoknak alávetett ingola testén fejlődött hólyagok, eltérően a korábban hazánkban kimutatott Dermocystidium paraziták okozta fertőzésektől, meglehetősen vékonynak mutatkoztak. A ciszták fehér színű, szemcsés folyadékot tartalmaztak spóraszerű képletek ezreivel. Ezek belső struktúrájuk tekintetében nem mutatták a klasszikusan a Dermocystidium parazitákra jellemző „félhold alakot” (nagy központi vakuólum, mely vékony sarló alakban a sejtfalhoz szorítja a citoplazmát és a sejtmagot), valamint nem képeztek az ezen fajokra gyakran jellemző hifafonalakat sem. Ez a sejtszerveződési eltérés, vélhetően a fertőzés korai stádiumával magyarázható, amikor is a spórákat még egy sokkal szemcsésebb struktúra jellemzi (Pekkarinen et al. 2003). Az érett spórák hiányában az általunk vizsgált fajt, pontosabb rendszertani megjelölés nélkül, csupán Dermocystidium-szerű parazitaként kezelhetjük.

A további vizsgálatok a parazita fajának pontos meghatározását illetően akadályokba ütköznek, mert azon túl, hogy egy fokozottan védett és folyamatosan csökkenő populációval rendelkező gazdafajról beszélünk, a fertőzött ivarérett egyedek begyűjtésére csupán néhány nap áll rendelkezésünkre tavasszal, az ívási időszak során.

A molekuláris vizsgálatok eredményei alapján elmondható, hogy jelen parazita a dermocisztid fajok monofiletikus csoportjában foglal helyet. Rokonságban áll a pisztráng- és sügérfélékből már korábban megismert Dermocystidium fajokkal, azonban azok mindegyikétől figyelemre méltó (> 2% bázissorrend) eltérés választja el, mely a gazdaszervezetek közötti filogenetikai távolságok figyelembevételével értelmezhető, ugyanis az ingolafélék az állkapcsos élőlényektől (Gnathostomata), beleértve a csontos halakat is, elkülönülő filogenetikai csoportot képeznek. Ezt a tényt figyelembe véve fontos hangsúlyozni, hogy jelen tanulmány az első, mely ezen ősi gerinces csoport (Cephalaspidomorphi) dermocisztid parazitás fertőzöttségéről szolgáltat adatokat.

Kulcsszavak: dermocisztid parazita, tiszai ingola, hólyagok, hisztológia, 18S rDNS

Köszönetnyilvánítás

Ezúton szeretnénk köszönetet mondani Lontay Lászónak, az Aggteleki Nemzeti Park természetvédelmi őrének a mintavételben nyújtott nélkülözhetetlen segítségért és tapasztalatainak megosztásáért, valamint Abonyi Tamás és Pádár Patrik egyetemi hallgatóknak a mintavétel során nyújtott segítségért.

Somogyi Dórát az Emberi Erőforrások Minisztériuma ÚNKP‐20‐3 kódszámú Új Nemzeti Kiválóság Programja támogatta.

A tanulmány alapjául szolgáló kutatást az Innovációs és Technológiai Minisztérium által meghirdetett Felsőoktatási Intézményi Kiválósági Program NKFIH-1150-6/2019 számon támogatta, a Debreceni Egyetem 4. tématerületi programja keretében.

Irodalom

Csaba G., Láng M. 1991. A ponty bőrében élősködő Dermocystidium erschowi megjelenése hazánkban. Halászat, 84, 109–111. (in Hungarian)

Eiras J.C., Silva-Souza A.T. 2000. Dermocystidium infection in Trichomycterus sp. (Osteichthyes, Trichomycteridae). Parasite, 7, 323–326. https://doi.org/10.1051/parasite/2000074323.

Elliott D.G. 2011. The Many Functions of Fish Integument. In: Farrell A.P., (ed.), Encyclopedia of Fish Physiology: From Genome to Environment, San Diego: Academic Press, 1, 471–475.

El-Mansy A. 2008. A new finding of Dermocystidium-like spores in the gut of cultured Oreochromis niloticus. Journal of Global Veterinary Research and Development, 2, 369–371.

Feist S.W., Longshaw M., Hurrell R.H., Mander B. 2004. Observations of Dermocystidium sp. infections in bullheads, Cottus gobio L., from a river in southern England. Journal of Fish Diseases, 27, 225–231. https://doi.org/10.1111/j.1365-2761.2004.00535.x

Fujimoto R.Y., Couto M.V.S., Sousa N.C., Diniz D.G., Madi R.R., Martins M.L, Eiras J.C. 2017. Dermocystidium sp. infection in farmed hybrid fish Colossoma macropomum × Piaractus brachypomus in Brazil. Journal of Fish Diseases, 41, 565–568. https://doi.org/10.1111/jfd.12761.

Glockling S.L., Marshall W.L., Gleason F.H. 2013. Phylogenetic interpretations and ecological potentials of the Mesomycetozoea (Ichthyosporea). Fungal Ecology, 6, 237-247.

González-Hernández M., Denoël M., Duffus A.J.L., Garner T.W.J., Cunningham A.A., Acevedo-Whitehouse K. 2010. Dermocystid infection and associated skin lesions in free-living palmate newts (Lissotriton helveticus) from Southern France. Parasitology International, 59, 344–350. https://doi.org/10.1016/j.parint.2010.04.006

Harka Á., Sallai Z. 2004. Magyarország halfaunája. Nimfea Természetvédelmi Egyesület, Szarvas, 269 p.

Hassan M.A., Osman H.A.M., Mahmoud M.A. 2014. Studies on Dermocystidiosis (Yellow Muscle Disease) among Some Marine Fishes of Arabian Gulf and Red Sea Coast, Jeddah, Saudi Arabia. Middle-East Journal of Scientific Research, 22(4), 478-487.

Kottelat M., Freyhof J. 2007. Handbook of European Freshwater Fishes. Kottelat, Cornol, Switzerland and Freyhof, Berlin, Germany, 646 p.

Mahboub H.H., Shaheen A.A. 2020. Prevalence, diagnosis and experimental challenge of Dermocystidium sp. infection in Nile tilapia (Oreochromis niloticus) in Egypt, Aquaculture, 516, doi: https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2019.734556.

Mendoza L., Taylor J.W., Ajello L. 2002. The class Mesomycetozoea: A group of microorganisms at the animal-fungal boundary. Annual Review of Microbiology, 56, 315–344. https://doi.org/10.1146/annurev.micro.56.012302.160950

Molnár K. 1979. Protozoan parasites of fish species indigenous in Hungary. Parasitologia Hungarica, 12, 5–8.

Molnár K., Sövényi J. 1984. Dermocystidium anguillae infection in elvers cultured in Hungary. Aquacultura Hungarica (Szarvas), 4, 71–78.

Molnár K., Müller T., Lefler K.K., Csorbai B. 2008. Dermocystidium fertőzöttség széles kárász szemében. Magyar Állatorvosok Lapja, 130, 53–56.

Pekkarinen M., Lom J., Murphy C.A., Ragan M.A., Dyková I. 2003. Phylogenetic Position and Ultrastructure of Two Dermocystidium Species (Ichthyosporea) from the Common Perch (Perca fluviatilis). Acta Protozoologica, 42, 287 – 307.

Sobecka E., Moskal J., Więcaszek B. 2009. Checklist of the pathogens of lamprey species of Poland. International Journal of Oceanography and Hydrobiology, 38, 129–137. https://doi.org/10.2478/v10009-009-0015-7

Steckert L.D., Cardoso L., Tancredo K.R., Martins M.L., Jeronimo G.T. 2019. Dermocystidium sp. in the gills of farmed Oreochromis niloticus in Brazil. Anais da Academia Brasileira de Ciencias, 91, e20180959. https://doi.org/10.1590/0001-3765201920180959

Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A., Kumar S. 2013. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution, 30, 2725–2729.

Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J. 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22, 4673–4680.

Zhang Q., Wang Z. 2005. Dermocystidium sp. infection in cultured juvenile catfish Silurus meridionalis in China. Diseases of Aquatic Organisms, 65, 245–250. https://doi.org/10.3354/dao065245