Ősivarsejtek mélyhűtése és átültetése: mi működik és mi nem?

HORVÁTH Ákos1, MARINOVIČ Zoran1, LUJIČ Jelena1, ŠČEKIČ Ilija1, HOITSY György2, FRANĔK Roman3, PŠENIČKA Martin3, URBÁNYI Béla1

1Szent István Egyetem, Természeti Erőforrások Megőrzése Intézet, Halgazdálkodási Tanszék, Gödöllő, Páter Károly utca 1. Horvath.Akos[kukac]szie.hu
2Hoitsy és Rieger Kft, Miskolc, Erzsébet sétány 55.
3University of South Bohemia in České Budějovice, FROV CENAKVA, Vodňany, Csehország

Kivonat

Bevezetés

Az ivarsejtek mélyhűtése az értékes fajok és fajták megőrzésének hatékony eszköze. A halak esetében csak a hímivarsejtek mélyhűthetők megbízhatóan, így a mélyhűtött sperma felhasználásakor az utód elkerülhetetlenül hibrid lesz. Ennek kiküszöbölésére dolgoztak ki kutatók módszereket az ősivarsejtek (primordiális, spermatogóniális és oogóniális ősivarsejtek) mélyhűtésére majd átültetésére (Yoshizaki et al. 2011). Öt évnyi kutatómunkánk során számos fajban dolgoztunk ki mélyhűtési módszereket, illetve végeztünk átültetéses vizsgálatokat. A vizsgálatok rávilágítottak arra is, hogy az ősivarsejtek átültetése nem csak sikerrel, hanem számos kudarccal is jár.


Anyag és módszer

A vizsgálatokat lazacfélékben, pontyfélékben és angolnafélékben végeztük. A halak ivarmirigyeit túlaltatást követően távolítottuk el. Mélyhűtéshez vagy az ivari szövet darabjait használtuk fel, vagy az azokból izolált sejtek szuszpenzióit. A sejtek túlélését Trypan kék élő-halott festéssel határoztuk meg. A mélyhűtés során a következő tényezők hatását vizsgáltuk a spermatogóniális és oogóniális őssejtek túlélésére:

  • szövetdarabok vagy sejtszuszpenziók mélyhűtése,
  • fagyasztás vagy vitrifikáció (jégkristályok képződése nélküli gyors hűtés),
  • különböző védőanyagok és azok koncentrációi,
  • cukor- és fehérjekiegészítők használata.

A frissen izolált vagy mélyhűtést követően felolvasztott sejteket megfelelő szűrést követően közeli rokon recipiens fajokba ültettük be. Lazacfélék esetében szivárványos pisztrángot (Oncorhynchus mykiss) és tigrispisztrángot (Salmo trutta m. fario × Salvelinus fontinalis), pontyfélék esetében zebradániót (Danio rerio) és aranyhalat (Carassius auratus) használtuk recipiensként. Az esetek nagy részében a sejtszuszpenziót a recipiensek frissen kelt lárváiba (az ivari redő környékére) ültettük be mikroinjektor segítségével. A tigrispisztráng esetében megpróbálkoztunk a kifejlett egyedekbe végzett beültetéssel az ivarmirigybe vezetett szilikonkatéter segítségével. Az átültetés sikerét a felboncolt recipiensek ivarszerveiben felfedezhető és a donor sejtekre jellemző fluoreszcens jellel, illetve a begyűjtött ivartermék (sperma) és a létrehozott ivadék molekuláris markerek segítségével végzett vizsgálatával igazoltuk.


Eredmények és következtetések

A lazacfélék esetében a sebes pisztráng (Salmo trutta m. fario) petefészek-szövetét mélyhűtöttük sikeresen. A szövetdarabokat akupunktúrás tűre húzva vitrifikátuk, és 3 M dimetil-szulfoxid (DMSO) és 3 M propilén-glikol (PG) védőanyag-összetételű hűtőmédium használata mellet a sejtek 40%-os túlélését tapasztaltuk (Lujić et al. 2017). A pontyfélék közül a compó (Tinca tinca) spermatogóniumai azonos túlélést mutattak sejtszuszpenzió és hereszövet-darabok fagyasztásakor, ugyanakkor az aranyhal esetében a szuszpenzióban lévő sejtek túlélése magasabb volt (Marinović et al. 2017). Zebradánióban is kipróbáltuk az akupunktúrás tűre húzott egész herék vitrifikációját és megfelelő körülmények között a spermatogóniumok 50%-a élte túl a mélyhűtést (Marinović et al. 2018, 2019). A ponty (Cyprinus carpio) hereszövetének mélyhűtésekor a fagyasztásos eljárás egyértelműen jobb túlélést eredményezett (40%), mint a vitrifikáció (12%) (Franěk et al., 2019a), ezért a petefészek-szövet mélyhűtésekor már csak fagyasztással próbálkoztunk jó eredménnyel (65% körüli túlélés) (Franěk et al. 2019b). Az angolnában (Anguilla anguilla) ugyanakkor mind a vitrifikáció, mind a fagyasztás az oogóniumok igen magas (közel 100%-os) túlélését eredményezte (Šćekić et al. 2020).

Átültetéses kísérleteink során lazacfélékben a sebes pisztráng és a pénzes pér (Thymallus thymallus) fluoreszcensen jelölt (PKH-26) spermatogóniumait és oogóniumait transzplantáltuk szivárványos pisztráng recipiensbe. Az átültetést követően 2 hónappal a recipiensek mintegy 26-28%-ban tapasztaltunk fluoreszcens jelet, illetve a donor-eredetű ivarsejtek jelenlétét a fajra jellemző molekuláris markerekkel is kimutattuk (Lujić et al. 2018). Az ivarérésig felnevelt triploid recipiensekben ugyanakkor a donor-eredetű sejtek már nem voltak kimutathatók és ivarterméket sem sikerült nyerni. A szivárványos pisztrángot donorként is használtuk azokban a vizsgálatainkban, amiben a tigrispisztráng, mint recipiens alkalmasságát kutattuk. A recipiens egyedeket felnevelve egy esetben sikerült spermát nyernünk és azzal sikeres termékenyítést végeznünk. A kapott ivadékot felnevelve fenotípusosan (1. ábra) és molekuláris módszerekkel is bizonyítottuk azok donor-eredetét. A tigrispisztrángban ugyanakkor igen magas mortalitást (95%) tapasztaltunk, illetve a további ivartermék nyerése iránti próbálkozásaink kudarccal végződtek.

1. ábra Tigrispisztráng (Salmo trutta m. fario × Salvelinus fontinalis) recipiens használata szivárványos pisztráng (Oncorhychus mykiss) spermatogóniumok átültetéséhez. a. donor-eredetű tej fejése felnevelt tigrispisztráng recipienstől; b. a recipienstől kinyert donor-eredetű tejjel termékenyített ikratételekből kikelt és felnevelt szivárványos pisztráng utódok (fotó: Hoitsy György).

A pontyfélékben végzett átültetéses vizsgálatainkban intraspecifikus transzplantációt végeztünk zebradánióban mind a vitrifikált herékből izolált, mind frissen kinyert spermatogóniumok felhasználásával. Ebben az esetben a recipienseket antiszensz morpholino oligonukleotidok segítségével sterilizáltuk, amelyek ivarszerve így csírahámtól mentes áttetsző szövet lett. Donorként zöld fluoreszcens transzgénikus zebradániót használtunk, ami lehetővé tette a recipienstől kinyert sperma, illetve az ezzel végzett termékenyítésből származó utódok azonosítását (Marinović et al. 2019). Ugyanezt a módszert használtuk aranyhal recipiensek sterilizálására a pontytól származó spermatogóniumok átültetésekor. A transzplantáció sikere kb. 40%-os volt, a felnevelt és felboncolt recipiensekben aktív spermatogenezis volt megfigyelhető. Az ivarmirigyekben fejlődő csírasejtek donor-eredetét molekuláris markerekkel is igazoltuk (Franěk et al. 2019a).


Összefoglalás

A halak ősivarsejtjeinek mélyhűtése és átültetése megfelelő recipiensbe jó alternatívát jelenthet a spermamélyhűtéssel szemben a genetikai tartalékok ex situ megőrzése során. Munkánk során sikeresen alkalmaztuk ezeket a módszereket lazacfélékben, pontyfélékben és angolnafélékben. Több faj esetében sikerült intra- és interspecifikus transzplantációt végrehajtani és donor-eredetű utódokat nyerni a recipienstől kinyert ivartermék felhasználásával. A módszernek ugyanakkor vannak korlátai is, ami elsősorban a lazacfélékben mutatkozott meg, ahol a fajok rendszertani távolsága nem, vagy csak korlátozottan tette lehetővé a beültetett ősivarsejtek sikeres proliferációját és a gametogenezist. Az angolna esetében bizonyítottuk, hogy az őscsirasejtek jól mélyhűthetők, azonban ehhez a fajhoz megfelelő recipiens találni egy igazi kihívás lesz.


Kulcsszavak: ősivarsejtek, spermatogónium, oogónium, mélyhűtés, vitrifikáció, átültetés


Köszönetnyilvánítás

A prezentáció elkészítését a EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00008 számú projekt támogatta. A projekt az Európai Unió támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával valósult meg.


Irodalom

Franěk R., Marinović Z., Lujić J., Urbányi B., Fučíková M., Kašpar V., Pšenička M., Horváth Á. 2019a. Cryopreservation and transplantation of common carp spermatogonia. PLoS One 14, e0205481.

Franěk R., Tichopád T., Steinbach C., Xie X., Lujić J., Marinović Z., Horváth Á., Kašpar V., Pšenička M. 2019b. Preservation of female genetic resources of common carp through oogonial stem cell manipulation. Cryobiology 87, 78–85.

Lujić J., Marinović Z., Sušnik Bajec S., Djurdjevič I., Kása E., Urbányi B., Horváth Á. 2017. First successful vitrification of salmonid ovarian tissue. Cryobiology 76, 154–157.

Lujić J., Marinović Z., Sušnik Bajec S., Djurdjevič I., Urbányi B., Horváth Á. 2018. Interspecific germ cell transplantation: a new light in the conservation of valuable Balkan trout genetic resources? Fish Physiol. Biochem. 44, 1487–1498.

Marinović Z., Lujić J., Kása E., Bernáth G., Urbányi B., Horváth Á., 2017. Cryosurvival of isolated testicular cells and testicular tissue of tench Tinca tinca and goldfish Carassius auratus following slow-rate freezing. Gen. Comp. Endocrinol. 245, 77–83.

Marinović Z., Lujić J., Kása E., Csenki Z., Urbányi B., Horváth Á. 2018. Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling. J. Vis. Exp. e56118.

Marinović Z., Li Q., Lujić J., Iwasaki Y., Csenki Z., Urbányi B., Yoshizaki G., Horváth Á., 2019. Preservation of zebrafish genetic resources through testis cryopreservation and spermatogonia transplantation. Sci. Rep. 9, 13861.

Šćekić I., Marinović Z., Lujić J., Müller T., Kitanović N., Urbányi B., Horváth Á., 2020. A novel strategy for conservation of European eel (Anguilla anguilla) genetic resources: Cryopreservation of ovarian stem cells. Cryobiology 95, 151–156.

Yoshizaki G., Fujinuma K., Iwasaki Y., Okutsu T., Shikina S., Yazawa R., Takeuchi Y., 2011. Spermatogonial transplantation in fish: A novel method for the preservation of genetic resources. Comp. Biochem. Physiol. Part D Genomics Proteomics 6, 55–61.

Programajánló

Jelenleg nincs aktuális esemény.