Három különböző módszer összehasonlítása a pontysperma (Cyprinus carpio) koncentrációjának méréséhez

PATAKI Bernadett, URBÁNYI Béla, KOLLÁR Tímea, HORVÁTH Ákos

Szent István Egyetem, Természeti Erőforrások Megőrzése Intézet, Halgazdálkodási Tanszék, Gödöllő, Páter Károly utca 1. Pataki.Bernadett[kukac]szie.hu

Kivonat

Bevezetés

Kísérletünkben három olyan módszert teszteltünk, amelyek által a ponty (Cyprinus carpio) sperma koncentrációjának mérése könnyebbé és gyorsabbá válik. Erre azért volt szükség, mert az eddig használt Bürker-Türk kamrával történő, mechanikus sejtszámolási módszer rendkívül időigényes, ezáltal megnehezíti az adott koncentrációval történő termékenyítést, mélyhűtést, illetve egyéb folyamatokat. Néhány halfajnál már sikerült megalkotni azt az egyenletet, amellyel könnyen kiszámolható a spermakoncentráció, ha ismerjük az abszorbancia értékét. 1992-ben Ciereszko A. és Dabrowski K. sárga sügér (Perca flavescens), szivárványos pisztráng (Oncorhynchus mykiss) és maréna (Coregonus clupeaformis) esetében talált lineáris összefüggést az abszorbancia és a sejtszám között.


Anyag és módszer

Kísérletünkhöz három különböző készüléket használtunk. Egy küvettás spektrofotométert (Shimadzu UV-VIS Spectrophotometer, UV mini 1240), egy plate leolvasó spektrofotométert (Thermo Scientific Varioskan Lux) és egy számítógépes spermavizsgáló rendszert (Computer-assisted sperm analysis – CASA, Minitüb GmbH, AndroVison).

A küvettás spektrofotométeres vizsgálathoz 6 db, a Szent István Egyetem Halgazdálkodási Tanszékén, recirkulációs rendszerben tartott ponty spermáját használtuk fel. A mintákból elsőként 10 µl-t higítottunk 990 µl pér higítóval (200 mM glükóz, 40 mM KCl, 30 mM Tris, pH 8.0), amelyeknek az abszorbanciáját 505 nanométeren mértük meg spektrofotométer segítségével. Ezt követően a már kihigított mintákból higítottunk 100 µl-t 900 µl pér hígítóval (1000-szeres hígítás), majd ezeknek a sűrűségét Bürker-Türk-féle sejtszámláló kamra segítségével állapítottuk meg. A hígításokat minden minta esetében háromszor ismételtük meg.

A plate leolvasó spektrofotométeres vizsgálathoz szintén 6 db, a Szent István Egyetem Halgazdálkodási Tanszékén, recirkulációs rendszerben tartott ponty spermáját használtuk fel. A mintákból 1 µl spermát hígítottunk 999 µl pér higítóval (200 mM glükóz, 40 mM KCl, 30 mM Tris, pH 8.0), majd 100 µl kihígított mintát helyeztünk lyukanként a plate-be (Thermo Scientific, BioLite 24 Well Multidish). A minták abszorbanciáját rázás után 505 nanométeren mértük meg. Ezt követően a kihígított minták sűrűségét Bürker-Türk kamra segítségével állapítottuk meg. A hígításokat minden minta esetében háromszor ismételtük meg.

A CASA-s vizsgálathoz 3 db, a Szent István Egyetem Halgazdálkodási Tanszékén, recirkulációs rendszerben tartott ponty spermáját használtuk fel. A három mintát 3 különböző hígítással hígítottuk ki háromszori ismétléssel (100x;200x;300x). A mintákat CASA segítségével fotóztuk le, amely kiszámolta az immobilizált minták sűrűségét. Ezek után a mintákat tovább hígítottuk (1000x;2000x;3000x), majd ezeknek a sűrűségét Bürker-Türk kamra segítségével is megállapítottuk.


Eredmények és következtetések

Kísérletünk során küvettás spektrofotométert használva lineáris összefüggést találtunk az abszorbancia és a koncentráció között (1. ábra), amely függvény egyenlete a következőképpen írható fel: Y = -2×1011x + 4×109 (R² = 0,7494).

1. ábra Spermakoncentráció és abszorbancia összefüggése küvettás spektrofotométerrel vizsgálva

A plate leolvasó spektrofotométerrel szintén lineáris összefüggést találtunk az abszorbancia és a koncentráció között (2. ábra), amely függvény egyenlete a következőképpen írható fel: Y = 2×1011x – 4×109 (R² = 0,8283)

2. ábra Spermakoncentráció és abszorbancia összefüggése plate leolvasó spektrofotométerrel vizsgálva

A CASA segítségével mért sűrűség és a Bürker-Türk kamra segítségével megállapított spermakoncentráció közötti összefüggés determinációs együtthatójának az értéke a következőként alakult: R² = 0,6902 (Y = 0,7901x + 2×108) amelyet a következő, 3. ábrán láthatunk.

3. ábra CASA és Bürker-Türk kamra segítségével mért spermakoncentráció közötti összefüggés


Összefoglalás

A spektrofotométerek közül a plate leolvasó spektrofotométer mért a legpontosabban, azonban a két spektrofotométerrel alkotott függvény egyenletének abszolútértéke megegyezik. A mérés a plate leolvasó spektrofotométerrel kevesebb hibalehetőséget rejt magában, mivel a mérés előtt a minta felrázható. A leggyengébb összefüggést a CASA-s spermakoncentráció mérésnél kaptuk. Következtetésként levonhatjuk, hogy a következő egyenlettel: Y = 2×1011x – 4×109, plate olvasó spektrofotométerrel kaphatjuk a legpontosabb eredményt.


Kulcsszavak: ponty, sperma, koncentráció, sejtszámolás, Cyprinus carpio


Köszönetnyilvánítás

A kutatás az Európai Unió és az Európai Szociális Alap támogatásával, az NKFIH K129127 és az EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00008 projekt által valósult meg.


Irodalom

Ciereszko A., Dabrowski K. 1993. Estimation of sperm concentration of rainbow trout, whitefish and yellow perch using a spectrophotometric technique. Aquaculture, 109(3-4), 367–373.

Programajánló

Jelenleg nincs aktuális esemény.