Három különböző módszer összehasonlítása a pontysperma (Cyprinus carpio) koncentrációjának méréséhez
PATAKI Bernadett, URBÁNYI Béla, KOLLÁR Tímea, HORVÁTH Ákos
Szent István Egyetem, Természeti Erőforrások Megőrzése Intézet, Halgazdálkodási Tanszék, Gödöllő, Páter Károly utca 1. Pataki.Bernadett[kukac]szie.hu
Kivonat
Bevezetés
Kísérletünkben három olyan módszert teszteltünk, amelyek által a ponty (Cyprinus carpio) sperma koncentrációjának mérése könnyebbé és gyorsabbá válik. Erre azért volt szükség, mert az eddig használt Bürker-Türk kamrával történő, mechanikus sejtszámolási módszer rendkívül időigényes, ezáltal megnehezíti az adott koncentrációval történő termékenyítést, mélyhűtést, illetve egyéb folyamatokat. Néhány halfajnál már sikerült megalkotni azt az egyenletet, amellyel könnyen kiszámolható a spermakoncentráció, ha ismerjük az abszorbancia értékét. 1992-ben Ciereszko A. és Dabrowski K. sárga sügér (Perca flavescens), szivárványos pisztráng (Oncorhynchus mykiss) és maréna (Coregonus clupeaformis) esetében talált lineáris összefüggést az abszorbancia és a sejtszám között.
Anyag és módszer
Kísérletünkhöz három különböző készüléket használtunk. Egy küvettás spektrofotométert (Shimadzu UV-VIS Spectrophotometer, UV mini 1240), egy plate leolvasó spektrofotométert (Thermo Scientific Varioskan Lux) és egy számítógépes spermavizsgáló rendszert (Computer-assisted sperm analysis – CASA, Minitüb GmbH, AndroVison).
A küvettás spektrofotométeres vizsgálathoz 6 db, a Szent István Egyetem Halgazdálkodási Tanszékén, recirkulációs rendszerben tartott ponty spermáját használtuk fel. A mintákból elsőként 10 µl-t higítottunk 990 µl pér higítóval (200 mM glükóz, 40 mM KCl, 30 mM Tris, pH 8.0), amelyeknek az abszorbanciáját 505 nanométeren mértük meg spektrofotométer segítségével. Ezt követően a már kihigított mintákból higítottunk 100 µl-t 900 µl pér hígítóval (1000-szeres hígítás), majd ezeknek a sűrűségét Bürker-Türk-féle sejtszámláló kamra segítségével állapítottuk meg. A hígításokat minden minta esetében háromszor ismételtük meg.
A plate leolvasó spektrofotométeres vizsgálathoz szintén 6 db, a Szent István Egyetem Halgazdálkodási Tanszékén, recirkulációs rendszerben tartott ponty spermáját használtuk fel. A mintákból 1 µl spermát hígítottunk 999 µl pér higítóval (200 mM glükóz, 40 mM KCl, 30 mM Tris, pH 8.0), majd 100 µl kihígított mintát helyeztünk lyukanként a plate-be (Thermo Scientific, BioLite 24 Well Multidish). A minták abszorbanciáját rázás után 505 nanométeren mértük meg. Ezt követően a kihígított minták sűrűségét Bürker-Türk kamra segítségével állapítottuk meg. A hígításokat minden minta esetében háromszor ismételtük meg.
A CASA-s vizsgálathoz 3 db, a Szent István Egyetem Halgazdálkodási Tanszékén, recirkulációs rendszerben tartott ponty spermáját használtuk fel. A három mintát 3 különböző hígítással hígítottuk ki háromszori ismétléssel (100x;200x;300x). A mintákat CASA segítségével fotóztuk le, amely kiszámolta az immobilizált minták sűrűségét. Ezek után a mintákat tovább hígítottuk (1000x;2000x;3000x), majd ezeknek a sűrűségét Bürker-Türk kamra segítségével is megállapítottuk.
Eredmények és következtetések
Kísérletünk során küvettás spektrofotométert használva lineáris összefüggést találtunk az abszorbancia és a koncentráció között (1. ábra), amely függvény egyenlete a következőképpen írható fel: Y = -2×1011x + 4×109 (R² = 0,7494).
A plate leolvasó spektrofotométerrel szintén lineáris összefüggést találtunk az abszorbancia és a koncentráció között (2. ábra), amely függvény egyenlete a következőképpen írható fel: Y = 2×1011x – 4×109 (R² = 0,8283)
A CASA segítségével mért sűrűség és a Bürker-Türk kamra segítségével megállapított spermakoncentráció közötti összefüggés determinációs együtthatójának az értéke a következőként alakult: R² = 0,6902 (Y = 0,7901x + 2×108) amelyet a következő, 3. ábrán láthatunk.
Összefoglalás
A spektrofotométerek közül a plate leolvasó spektrofotométer mért a legpontosabban, azonban a két spektrofotométerrel alkotott függvény egyenletének abszolútértéke megegyezik. A mérés a plate leolvasó spektrofotométerrel kevesebb hibalehetőséget rejt magában, mivel a mérés előtt a minta felrázható. A leggyengébb összefüggést a CASA-s spermakoncentráció mérésnél kaptuk. Következtetésként levonhatjuk, hogy a következő egyenlettel: Y = 2×1011x – 4×109, plate olvasó spektrofotométerrel kaphatjuk a legpontosabb eredményt.
Kulcsszavak: ponty, sperma, koncentráció, sejtszámolás, Cyprinus carpio
Köszönetnyilvánítás
A kutatás az Európai Unió és az Európai Szociális Alap támogatásával, az NKFIH K129127 és az EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00008 projekt által valósult meg.
Irodalom
Ciereszko A., Dabrowski K. 1993. Estimation of sperm concentration of rainbow trout, whitefish and yellow perch using a spectrophotometric technique. Aquaculture, 109(3-4), 367–373.
Programajánló
Hírek
Tisztelt Látogatók!
A hazai agrár-felsőoktatás szükséges megújulásának mérföldköve az alapítványi fenntartású Magyar Agrár- és Élettudományi Egyetem (MATE) létrejötte, amely 2021. február 1-től 5 campuson, több mint 13 ezer hallgató számára fogja össze a dunántúli és közép-magyarországi élettudományi és kapcsolódó képzéseket. Az intézményhez csatlakozik a Nemzeti Agrárkutatási és Innovációs Központ (NAIK) 11 kutatóintézete is, így az új intézmény nem csupán egy oktatási intézmény lesz, hanem az ágazat szellemi, szakpolitikai és innovációs központjává válik, amely nagyobb mozgásteret biztosít a képzések, a gazdálkodás és szervezet modernizálásához, fejlesztéséhez. Az összeolvadással magasabb fokozatra kapcsolunk, a kutatói és egyetemi szféra szorosabban fonódik majd össze, aminek következtében még több érdekes, izgalmas kutatás-fejlesztés születhet majd az agrárium területén.
Kérjük, kövesse tevékenységünket a jövőben is a www.uni-mate.hu honlapon!
A szokásostól eltérően az idei évben ősszel, október 03-04 között került megrendezésre az Ultrabalaton csapatversenye. NAIK-os csapat az idei évben állt először rajthoz a 14. alkalommal kiírt versenyen.