ELŐZETES EREDMÉNYEK AFRIKAI HARCSA (CLARIAS GARIEPINUS) POPULÁCIÓK GENETIKAI VIZSGÁLATÁHOZ

KÁNAINÉ SIPOS Dóra¹, BALOGH Réka¹, IHÁSZ Katalin¹, KESZTE Szilvia¹, HEGYI Árpád¹, MÜLLER Tamás¹, VARJU-KATONA Milán², KOVÁCS Gyula³, SZILÁGYI Gábor², URBÁNYI Béla¹, KOVÁCS Balázs¹

¹Szent István Egyetem, Természeti Erőforrások Megőrzése Intézet, Halgazdálkodási Tanszék, Gödöllő, Páter Károly utca 1. Kovacs.Balazs[kukac]szie.hu
²Győri „Előre” Halászati termelőszövetkezet, Kisbajcs, Arany János utca 22. varju.milan[kukac]gmail.com
³NAIK HAKI, Szarvas, Anna-liget utca 35. kovacs.gyula[kukac]haki.naik.hu

Kivonat

Bevezetés

Az afrikai harcsa (Clarias gariepinus, Burchell, 1822) Afrikában és a Közel-Keleten őshonos, de Európában, Ázsiában és Dél-Amerikában is tenyésztik. Fontos erőforrást jelent számos fejlődő országban. Termelése az utóbbi évtizedben több tízszeresére, több mint 200 000 tonnára nőtt (FAO 2016). Az egyre intenzívebb tenyésztés hatással van az európai változat genetikai hátterére, de az ellenőrizetlen állomány telepítések és fokozott kereskedelem miatt a természetes populációkra is (Barasa és mtsai. 2017¸ Holmlund és mtsai. 2004). A Magyarországon tenyésztett, holland eredetű változat genetikai vizsgálata azonban mindezidáig nem történt meg. A faj genetikai hátterének vizsgálatára hatékonyan alkalmazható fajspecifikus mikroszatellitek állnak rendelkezésre (Kánainé és mtsai. 2019), kutatásaink során ezeket alkalmazzuk a hazánkban tenyésztett változat elemzésére.

Anyag és módszer

A vizsgált afrikai harcsa egyedek a Magyarországi NAIK-HAKI Szarvas állományából származtak (GPS: 46°52′0.01" N 20°33′0.0.00" E). Az állományt a 80-as évek közepén alapították, és egy intenzív RAS rendszerben tartják fent időszakos frissítéssel. A genetikai elemzésekhez 32 egyed farokúszó mintáit (0,5 cm² szövet) használtuk fel. A genomiális DNS-t E.Z.N.A. DNS Tissue Kit (Omega BioTek) segítségével izoláltuk. A DNS-t 50 ng/μl koncentrációra hígítottuk a mikroszatellit elemzésekhez, és -20 °C-on tároltuk tároló pufferben. A mikroszatellitek kimutatására a Shimizu és munkatársai (2001) által leírt detektálási eljárást alkalmaztuk. A mikroszatellitek forward primereinek 5’ végéhez egy 17 bázispár hosszú farok szekvenciát adtunk (5′ATT ACC GCG GCT GCTGG- mikroszatellit-specifikus primer-3′) A normál PCR eljárást egy ehhez tapadó fluoreszcensen jelölt (FAM vagy VIC vagy NED vagy PET) farok-specifikus oligóval egészítettük ki. A PCR reakciók térfogata 25 μl volt, összetétele: 1× Taq DNS polimeráz puffer (Fermentase), amely (NH₄)₂SO₄ vagy KCl-t tartalmazott attól függően, hogy melyik bizonyult hatékonyabbnak (KCl-ot tartalmazó puffer a következő markerek esetében volt hatékonyabb Cg02, Cg03, Cg10, Cg40, Cg122 és Cg132 markerek), 264 nM forward és reverse, valamint 132 nM fluoreszcensen jelölt primerek, 1,5–3,0 mM MgCl₂ (Fermentas), 0,2 mM dNTP (Fermentas), 0,04 U/μl Taq DNS polimeráz (Fermentas) és 150 ng DNS. A hőprofil a következő volt: előzetes denaturálás 95 °C-on 2 percen keresztül, amelyet két előciklus (95 °C/15 s; ann.temp./1 min; 72 °C/2 min) és 35 (Cg002, Cg003, Cg010, Cg040, Cg122 és Cg132, Cg367, Cg652, Cg665) vagy 45 amplifikációs ciklus (95 °C/15 s; ann. temp./20 s; 72 °C/40 s) követett. A reakciók 5 perc, 72 °C végső lánchosszabbítással zárultak. A genotípusokat a 3130 genetikai analizátorral (Applied Biosystems) vizsgáltuk GeneScan LIZ 500 molekulasúly marker és POP7 polimer segítségével (Applied Biosystems). Az allélok méretét GeneMapper 4.0 szoftver segítségével (Applied Biosystems) határoztuk meg. Az allél számok és a polimorf információtartalom (PIC) meghatározására Microsatellite Toolkit ver. 3.1.1 (Park S.D.E. 2001) szoftvert alkalmaztunk lókuszonként. A várt és megfigyelt heterozigozitások vizsgálatára, illetve Hardy – Weinberg egyensúlytól való (HWE) eltérés szignifikanciájának vizsgálatára a GenAlEx ver. 6.5 (Peakall R. és Smouse P.E. 2012) programot alkalmaztuk. A Linkage Disequilibrium lehetőségét Genetix 4.05 programmal (Belkhir és mtsai. 2004) vizsgáltuk. Az apasági és egyedi azonosításhoz szükséges minimális markertesztet PARFEX v1.0 program segítségével számítottuk (Sekino M. és Kaheki S. 2012). A rokonsági kapcsolatok vizsgálatára az ML-Relate-szoftvert alkalmaztuk (Kalinowski és mtsai. 2006). A genotipizálási hibák és null allél jelenlétét MIKRO-CHECKER 2.2.3 programmal vizsgáltuk (Van Oosterhout és mtsai. 2004) míg a beltenyésztés együtthatót (Fis) az FSTAT 2.9.3 szoftverrel számoltuk (Goudet J. 1995).

Eredmények és következtetések

A vizsgálatban 49 Clarias gariepinus mikroszatellitet jellemeztünk annak érdekében, hogy a közülük kiválasztott markerekkel átfogóbb genetikai vizsgálatokat végezzünk a magyar és európai állományokon a jövőben. Összesen 32 egyed genotípusát határoztuk meg mikroszatellit markerekkel. A markerek egyike sem volt monomorf. Az allélok száma lókuszonként 2 és 11 között változott, az átlagos allélszáma azonban mérsékelt volt (5,06 ± 1,9), összehasonlítva az édesvízi halak átlagával (9,1 ± 6,1), valamint a tenyésztett és természetes afrikai harcsapopulációkkal (3,80 ± 0,84 és 10,83 ± 3,66 között). Kenyában (Barasa és mtsai. 2017; De Woody J.A. és Avise J.C. 2000) A Cg175 marker esetében volt legmagasabb az allélok száma (11), de a Cg003 és Cg010 markerek is magas polimorfitásúnak bizonyultak. Az átlagos polimorf információs tartalom (PIC) értéke 0,499 (0,142-0,763) volt. A vizsgált lókuszok közül 27 magas polimorfitást (PIC > 0,5), 18 a mérsékelt (0,2 < PIC < 0,5), négy pedig alacsony polimorfitást (PIC < 0,2) mutatott a vizsgált csoportban. A várt heterozigozitás (H_E) a lókuszok között 0,147 (Cg346) és 0,793 (Cg175) között mozgott, 0,544 (SE: 0,024) átlaggal, míg a megfigyelt heterozigozitás (H_O) 0,031 (Cg663) és 1,00 (Cg003) között változott, 0,519 (SE: 0,037) átlaggal. Harmincegy lókusz jelentős eltérést mutatott a HWE-tól. Az eltérés részben a 24 lókuszon megfigyelt heterozigóta hiányának köszönhető, másrészt hét lókusznál heterozigóta többlet volt kimutatható. Ennek oka feltehetően az állomány mesterséges fenntartásának gyakorlati következménye. A szelekció, a mesterséges szaporítás, a tenyészállomány méretének ingadozása vagy az állomány ritka és nem szisztematikus keresztezése, frissítése szintén magyarázhatja a HWE-tól való eltéréseket (Smouse és mtsai. 2015; Allendorf és mtsai. 2013, Endo és mtsai. 2018). A hosszú távú zárt intenzív tenyésztés egyik genetikai hatása lehet a genetikai változékonyság csökkenése és a beltenyésztés. Ezeket a hatásokat Wachirachaikarn és munkatársai is leírták néhány tájföldi és a dél-indiai (Ezilrani és mtsai. 2016) harcsapopulációban is. Míg az afrikai gazdaságokban alkalmazott "nyitott" tenyésztési rendszer a változatosság (rendszeresen gyűjtenek hím egyedeket a természetes élőhelyekről, hogy biztosítsák a tejet) magasabb, mint a természetes tavakban (Barasa és mtsai. 2017). Tizenkét marker esetében feltételezhető volt a null allél valószínűsége, ami lehet a nagyszámú rokonsági kapcsolat vagy az elemzett egyedek kis számának következménye is, ezért ennek további vizsgálatára szükség lehet. A rokonsági kapcsolatok vizsgálata során sem az allél kizárás, sem Maximum Likelihood módszerek nem azonosítottak szülő-utód kapcsolatokat. Azonban a Maximum Likelihood elemzése alapján nagyszámú teljes- és fél-testvér rokonság feltételezhető a vizsgált egyedek között. Minden egyed legalább két másik egyeddel volt rokonsági kapcsolatban, míg háromnak tíz valószínűsíthető rokona volt. Mindezek mellett 16 marker esetében a számítások kapcsoltság jelenlétét mutatták ki, amit azonban a nagyszámú rokon egyed jelenléte is okozhatott, amelyek befolyásolták a véletlenszerű eloszlást. A csoport teljes F_IS-értéke 0,063 volt, azonban markerenként széles tartományban (− 0,709 és 0,899 között) változott. Huszonkilenc marker pozitív, míg 20 negatív F_IS értékkel rendelkezett. Az eredmények segítségével meghatároztuk azt a javasolt markerszettet, amely a 99% feletti valószínűséggel alkalmas egyedi és szülői azonosításra. A markerszett az alábbi 14 markert tartalmazza: Cg003, Cg010, Cg132, Cg175, Cg214, Cg287, Cg294, Cg299, Cg341, Cg352, Cg370, Cg639, Cg647, Cg661. Ezek a markerek fontos genetikai eszköztárként szerepet játszhatnak az afrikai harcsa populációk és a közeli rokonságban álló fajok populációinak genetikai elemzésében és tenyésztési programjaiban. A bemutatott előzetes eredmények alapján a magyar és feltehetően az európai állományok alaposabb genetikai vizsgálata nagyszámú egyeden, vagy teljes tenyészállományokon indokolt.

Összefoglalás

Az afrikai harcsa (Clarias gariepinus) az egyik legfontosabb intenzív rendszerben tenyésztett faj Magyarországon. Számos afrikai, ázsiai és európai országban termelik. Ráadásul az elmúlt évtizedekben termelése világszerte jelentősen nőtt. Jelenleg a pontyot követően ez a faj Magyarország második legnagyobb mennyiségében előállított hala. Gazdasági jelentősége ellenére az állományokat genetikai ellenőrzés vagy irányított nemesítés nélkül tartják fenn. A tenyésztett populációkra vagy törzsekre vonatkozó molekuláris genetikai adatok nagyon korlátozottak. Az állományok genetikai szerkezetének vizsgálata érdekében 49 mikroszatellit markert vizsgáltunk 32 egyeden egy magyar tenyésztett állományból. Valamennyi vizsgált marker polimorf volt. Az allélok száma lókuszonként 2 és 11 között mozgott. A megfigyelt és várható teljes heterozigótaság 0,519 és 0,544 között változott, és a teljes beltenyészeti együttható (F_IS: 0,063) nem mutatja a beltenyésztettség jelenlétét. A markerek 63%-a azonban jelentős eltéréseket mutatott a HWE-tól. Ugyanakkor nagyszámú rokonsági kapcsolat meglétét feltételezhetjük az állományon belül. Az eredmények arra utalnak, hogy a genetikai variáció fenntartása az állományon belül nagy figyelmet igényel a zártan tenyésztett populációkban. A vizsgálatok során azonosítottunk 14 mikroszatellit markert, amelyek nagy hatékonysággal használhatók fel populációk elemzésére, a rokonsági kapcsolatok feltárására, a természetes és tenyésztett afrikai harcsapopulációk esetében egyaránt. E markerek segítségével szeretnénk egy átfogó genetikai vizsgálatot végezni a magyar és európai állományokon a jövőben.

Kulcsszavak: afrikai harcsa, Clarias geriepinus, mikroszatellit, populáció, genetika

Köszönetnyilvánítás

Az Innovációs és Technológiai Minisztérium ÚNKP-19-3- I kódszámú Új Nemzeti Kiválóság Programjának szakmai támogatásával készült. A munkát az EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00008, az iFishIENCi projekt (European Union’s Horizon 2020 research and innovation programme under grant agreement No 818036) és a Halászati Operatív Program III. tengelye (“Európai Halászati Alap: a megújuló halászatért” - az Európai Unió és Magyarország támogatásával) projektek támogatták. A projekt az Európai Unió támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával valósult meg.

Irodalom

Barasa J., Mdyogolo S., Abila R., Grobler P.J., Skilton R., Bindeman H., Njahira N.M., Chemoiwa E., Dangasuk O.G., Kaunda-Arara B., Verheyen E. 2017. Genetic diversity and population structure ofthe African catfish, Clarias gariepinus (Burchell, 1822) in Kenya:implication for conservation and aquaculture. Belg J Zool.

Belkhir K., Borsa P., Chikhi L., Raufaste N., Bonhomme F. 2004. 1996–2004 GENETIX 4.05, logiciel sous Windows TM pour lagénétique des populations. Laboratoire Génome, Populations,Interactions, CNRS UMR 5171, Université de Montpellier II,Montpellier (France)

De Woody J.A., Avise J.C. 2000. Microsatellite variation in marine,freshwater and anadromous fishes compared with other animals.J Fish Biol.

FAO 2016. Fishery and Aquaculture Statistics Statistiques despęches et de l’ aquaculture Estadísticas de pesca y acuicultura.Fao.

Goudet J. 2001. FSTAT, a program to estimate and test genediversities and fixation indices, ver. 2.9.3. AN UPDATE FORGoudet J (1995). FSTAT (vers. 1.2): a computer program to calculateF-statistics. J Hered. 86:485–186.

Holmlund C.M., Hammer M. 2004. Effects of fish stocking onecosystem services: an overview and case study using the Stockholmarchipelago. Environ Manage.

Kalinowski S.T., Wagner A.P., Taper M.L. 2006. ML-Relate: acomputer program for maximum likelihood estimation of relatednessand relationship. Mol Ecol Not.

Kánainé Sipos D., Bakos K., Ősz Á. 2019. Development and characterization of 49 novel microsatellite markers in the African catfish, Clarias gariepinus (Burchell, 1822). Mol Biol Rep 46, 6599–6608 https://doi.org/10.1007/s11033-019-05062-5

Park S.D.E. 2001. Trypanotolerance in West African cattle and thepopulation genetics effects of selection. Ph.D. thesis, Universityof Dublin6608

Peakall R., Smouse P.E. 2012. GenALEx 6.5: genetic analysis inExcel. Population genetic software for teaching and research-anupdate. Bioinformatics.

Sekino M., Kakehi S. 2012. PARFEX v1.0: an EXCEL TM basedsoftware package for parentage allocation. Conserv Genet Res4(275), 278.

Shimizu M., Kosaka N., Shimada T. 2002. Universal fluorescentlabeling (UFL) method for automated microsatellite analysis.DNA Res.

Van Oosterhout C., Hutchinson W.F., Wills D.P.M., Shipley P. 2004. MICRO-CHECKER: software for identifying and correcting genotypingerrors in microsatellite data. Mol Ecol Not.

Wachirachaikarn A., Rungsin W., Srisapoome P., Na-Nakorn U. 2009. Crossing of African catfish, Clarias gariepinus (Burchell,1822) strains based on strain selection using genetic diversity data.Aquaculture.