Az első sikeres hibridizáció a vágótok (Acipenser gueldenstaedtii) és az amerikai lapátorrú tok (Polyodon spathula) között, mely életképes utódokat eredményezett

KÁLDY Jenő¹, MOZSÁR Attila¹, FAZEKAS Gyöngyvér¹, FARKAS Móni¹, FAZEKAS Dorottya¹, FAZEKAS Georgina¹, GODA Katalin², GYÖNGY Zsuzsanna², KOVÁCS Balázs³, SEMMENS Ken⁴, BERCSÉNYI Miklós⁵, MOLNÁR Mariann⁶, PATAKINÉ VÁRKONYI Eszter⁶

¹Nemzeti Agrárkutatási és Innovációs Központ, Halászati Kutatóintézet, Szarvas, mozsar.attila[kukac]haki.naik.hu; fazekas.gyongyver[kukac]haki.naik.hu; farkas.moni[kukac]haki.naik.hu; fazekas.dorottya.lilla[kukac]haki.naik.hu; fazekas.georgina[kukac]haki.naik.hu;
²Debreceni Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet, Debrecen, goda[kukac]med.unideb.hu; gyongy.zsuzsanna[kukac]med.unideb.hu
³Szent István Egyetem, Akvakultúra és Környezetbiztonsági Intézet, Halgazdálkodási Tanszék, Gödöllő, Kovacs.Balazs[kukac]mkk.szie.hu
⁴School of Aquaculture and Aquatic Sciences, Kentucky State University, Frankfort, USA, ken.semmens[kukac]kysu.edu
⁵Szent István Egyetem, Georgikon Kar, Állattudományi Tanszék, Keszthely, miklosbercsenyi77[kukac]gmail.com
⁶Nemzeti Biodiverzitás- és Génmegőrzési Központ, Haszonállat-génmegőrzési Intézet, Gödöllő, molnar.mariann[kukac]nbgk.hu; varkonyi.eszter[kukac]nbgk.hu

Kivonat

Bevezetés

A tokalakúak rendjén belül (Acipenseriformes) jelenleg két élő család található, a tokfélék (Acipenseridae) és a kanalastok-félék (Polyodontidae) családja. A tokfélék családjába 27 ma is élő faj tartozik, míg a kanalastok-félék családjába már csak egy, miután a kínai kanalas tokot (Psephurus gladius) 2020-ban kihalt fajnak nyilvánították (Zhang et al., 2020).

A dunai génállományú vágótok génmegőrzési, valamint állomány-megerősítési kutatásai ráirányítják a figyelmet olyan szaporítási módszerek alkalmazására, melyek nem szokványosak, de lehetővé teszik, hogy akár egyetlen, természetes vizeinkből begyűjtött nőivarú egyedet is lehessen szaporítani, ezáltal az egyedtől ivadékot nyerni, így megőrizve az egyed génállományát.

A tokfélék meiotikus ginogenezis módszerével történő szaporítása megoldott, azonban a vágótok esetében a módszer még alaposabb kidolgozásra szorul. Ugyanis a nagyszámú ivadék összes egyedének genetikai ellenőrzése lassú és drága folyamat, ezért, hogy biztosak legyünk abban, hogy a szaporítási folyamatból származó utódok bizonyosan vágótokok, olyan faj spermáját célszerű használni a termékenyítéshez, mellyel a vágótok nem tud hibridizálni. Ugyanis, ha a besugárzás nem fragmentálja minden spermiumsejt DNS tartalmát, akkor így az ép DNS tartalmú spermiumsejt nem eredményez hibridet, melynek a természetes vizekben való megjelenése nem kívánatos.

Anyag és módszer

A vágótokon végzett meiotikus ginogenezis kísérlethez az amerikai lapátorrú tok spermáját választottunk, egyrészt azért, mert régóta ismert, hogy a tokfélék családjának tagjai között a természetes és mesterséges hibridizáció könnyen végbemenő folyamat, másrészt, mert Mims S.D. és Shelton W.L. (1998) már publikáltak olyan hibridizációs kísérleteket az ásóorrú tok (Scaphirhynchus platorynchus) és a lapátorrú tok (Polyodon. spathula) között, melyek nem eredményeztek életképes utódokat. Ez alapján, illetve a nagy evolúciós távolság (a vágótok evolúciója során egy genom duplikáción esett át, ezért normál egyedei tetraploidok, míg a lapátorrú egyedek diploidok) alapján feltételezhető volt, hogy e két faj keresztezése szintén nem eredményez majd életképes utódokat.

A meiotikus ginogenezis szaporítási kísérletben két vágótok ikrást és egy lapátorrú tok tejest használtunk. A lapátorrú tok spermáját két részre osztottuk, az egyik részt gamma sugárzással besugároztuk, a másikat pedig kezeletlenül hagytuk. Mind a besugárzott, mind a natív spermát 1:200 arányban hígítottuk, majd elvégeztük a termékenyítést és az ikrákat 16 °C hőmérsékletű keltető vízben inkubáltuk. A keltető víz oxigéntelítettsége 90 % fölött volt a keltetés időtartama alatt. Azt tapasztaltuk, hogy a natív spermával termékenyített ikra is termékenyült, sőt életképes lárvák keltek ki. Hogy a tévedés lehetőségét kizárjuk, megismételtük a kísérletet a Neptun Bt. ercsi telephelyén Szilágyi Ákos ügyvezető segítségével. A HAKI génbankjából származó három lapátorrú tok egyedet fejtünk le, és a három egyed spermájával termékenyítettünk egy vágótok egyedtől származó 120-120-120 ml ikrát. Mind a három ikratételt 3 ml, 1:200 arányban higított spermával termékenyítettük. Így a spermaadó faj három ismétlésben vett részt a kísérletben. Mindhárom termékenyített ikratételt a HAKI halkeltetőjébe szállítottuk, ahol minden ikraadagot külön Zuger-üvegben helyeztünk el. A keltető víz hőmérséklete ez esetben is 16 °C volt, míg a keltető víz oxigéntelítettsége 90 % fölötti. Az egyes tételek termékenyülését hat óra elteltével állapítottuk meg, a termékenyülés 88±0,5-98±0,6% között volt minden esetben.

Eredmények és következtetések

A hibrid utódokon több genetikai elemzést is elvégeztünk. A sejtmagok DNS mennyiségét áramlási citométerrel határoztuk meg, melynek eredményét az első táblázat mutatja.

1. táblázat A DNS mennyiség és a funkcionális ploiditás alakulása az egyes szülő kombinációk esetében. (a táblázatban található 2E.75, 596B, 551F, 6517 az apai egyedek egyedi azonosító számai, míg a 6F15, 1748, Ag03 az anyaegyedek egyedi azonosító számai.)

Minden szülő kombináció esetében két eltérő DNS mennyiségű utódformát találtunk, azonban az eltérő DNS mennyiségű utódok aránya szülőkombinációnként eltérő volt. A tokfélék esetében előfordulhat, hogy a második meiotikus osztódás során visszamaradt második poláros test megnöveli az utód kromoszóma számát, azaz ploiditását (Havelka et al., 2016). A két faj közötti hibridizáció esetében ez a folyamat spontán lejátszódik az egyedek egy részénél, így két eltérő ploiditás fokú életképes hibrid forma keletkezik (1. ábra).

1. ábra Egy tipikus triploid hibrid (A) és egy tipikus pentaploid hibrid (B)

Az eltérő DNS mennyiségű egyedek kromoszómaszámát megvizsgálva azt tapasztaltuk, hogy a kromoszómaszámok tekintetében is elkülöníthető volt a két csoport. A triploid (3n) csoportban 156±4 és 174±10 között volt a kromoszómák száma, míg a pentaploid (5n) hibridek esetében ez a szám átlagosan 304±6 kromoszóma volt. Érdekes tény, hogy mindkét csoport egyes egyedeinél előfordult haploid sejtvonal (n=60), feltételezhetően a polispermia eredményeként. Azonban találtunk olyan kiugróan magas kromoszómaszámú sejteket is (n=430), melyek mozaikosságra utalhatnak (2. ábra).

2. ábra Egy triploid (3n) egyed (D52B1B) n=168 kromoszómaszámú sejtje (a) és ugyanennek az egyednek egy n=66 kromoszómaszámú sejtje (b), valamint egy pentaploid (5n) egyed (D522C1) n=306 kromoszómaszámú sejtje (c) és ugyanennek az egyednek egy n=430 kromoszómaszámú sejtje (d).

A hibridizáció tényét megvizsgáltuk mikroszatellit marker analízissel is. Az analízishez 4 markert használtunk fel (SPL_101, PSP_28, PSP_29 és PSP_32). Ezek a markerek mind a szülő egyedekben, mind a hibrid egyedekben jól kimutathatóak voltak, és a hibridizáció tényén túl, ez a vizsgálat bizonyította, hogy mind a triploid, mind a pentaploid egyedekben csak egyetlen haploid apai (lapátorrú tok) kromoszóma készlet találgató. E mellett a triploid egyedek egy normál ivarsejtképződésből származó kromoszóma készletet (az evolúciós genomduplikáció következtében 2n), a pentaploid egyedek pedig duplikálódott kromoszóma készletet (4n) örököltek a vágótok anyától. A hibrid egyedeket megvizsgáltuk morfológiai bélyegeik alapján is. Megállapítható, hogy összességében mind a morfometrikus, mind a merisztikus bélyegeik alapján nagy egyedi változékonyságot mutatnak az egyes egyedek. A hátvértek és oldalvértek számában a pentaploid egyedek egymáshoz képest kevésbé voltak változatosak, míg triploid társaiktól szignifikáns eltérést mutattak. Azonban mind a morfometrikus, mind a merisztikus bélyegek tekintetében mindkét hibrid forma az anyai vágótok fajjal mutat nagyobb hasonlóságot, míg az apai lapátorrú tok fajtól jobban eltér a fenotípusos bélyegek tekintetében.

Összefoglalás

Eredményeink alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy bár e két faj 184,4 millió évvel ezelőtt különvált egymástól (Peng et al., 2007), poliploid státuszuknak köszönhetően képesek arra, hogy hibridizáljanak egymással, és így életképes utódok fejlődjenek. A hibrid halak rendkívül változatosak mind küllemi, mind genetikai tulajdonságaikat illetően.

Jelenlegi tudásunk szerint ezek a hibrid egyedek valószínűleg sterilek lesznek, azonban arra mindenképpen felhívják a figyelmet, hogy a két faj közötti földrajzi elkülönülés fenntartása mindenképp célszerű.

Kulcsszavak: tokfélék, kanalastok-félék, meiotikus ginogenezis, DNS mennyiség, kromoszómaszám, morfológia, mikroszatellit marker analízis

Köszönetnyilvánítás

Szeretnénk, köszönetet mondani Feledi Tibornak, aki munkájával és szaktanácsaival támogatta munkánkat, továbbá Szilágyi Ákosnak, aki lehetőséget biztosított a második termékenyítés elvégzéséhez és Demény Ferencnek, aki a keltetés alatt munkájával és hasznos tanácsaival támogatta munkánkat.

Irodalomjegyzék

Havelka M., Bytyutskyy D., Symonová R., Ráb P., Flajšhans M. 2016. The second highest chromosome count among vertebrates is observed in cultured sturgeon and is associated with genome plasticity. Genet. Sel. Evol. 48, 12; doi:10.1186/s12711-016-0194-0.

Mims S.D., Shelton W.L. 1998. Induced meiotic gynogenesis in shovelnose sturgeon. Aquaculture International 6:323–329; doi.org/10.1023/A:1009280804945

Peng Z., Ludwig A., Wang D., Diogo R., Wei Q., He S. 2007. Age and biogeography of major clades insturgeons and paddlefishes (Pisces: Acipenseriformes). Mol. Phyl. Ev., 42, 854–862; doi:10.1016/j.ympev.2006.09.008

Tiersch T.R., Chandler R.W., Wachtel S.S., Elias S. 1989. Reference Standards for Flow Cytometry and Application in Comparative Studies of Nuclear DNA Content. Cytometry. 10, 706–710; doi:10.1002/cyto.990100606.

Zhang H., Jarić I., Roberts D.L., He Y., Du H., Wu J., Wang Ch., Qiwei Wei Q. 2020. Extinction of one of the world's largest freshwater fishes: Lessons for conserving the endangered Yangtze fauna. Science of The Total Environment. 710, 136242; doi:10.1016/j.scitotenv.2019.136242