A BALATONI KŐSÜLLŐ (SANDER VOLGENSIS) HÍMIVARSEJT MINŐSÉGÉNEK ÉS MÉLYHŰTÉSÉNEK VIZSGÁLATA

NAGY Borbála¹*, BERNÁTH Gergely¹, VÁRKONYI Levente¹, FODOR Ferenc², KOLTAI Tamás², BODNÁR Ádám², MOLNÁR József¹, LÁNG Levente Zete¹, IZSÁK Tibor¹, STASZNY Ádám¹, FERINCZ Árpád¹, BIRKÓ-SULYOK Zita Katalin¹, URBÁNYI Béla¹, SZÁRI Zsolt², BOKOR Zoltán¹

¹Szent István Egyetem, Mezőgazdaság- és Környezettudományi Kar, Akvakultúra és Környezetbiztonsági Intézet, Halgazdálkodási Tanszék , Gödöllő, Páter Károly út 1./Agárd, nagy.borbala[kukac]szie.hu
²Balatoni Halgazdálkodási Nonprofit Zrt., Siófok, Horgony u.1.

Kivonat

Bevezetés

A kősüllő egy Közép- és Kelet-Európában fellelhető halfaj. Húsának minősége közeli

rokonáéhoz, a süllőéhez (Sander lucioperca) hasonlóan kiváló. Állománya az utóbbi két évtizedben jelentős mértékben lecsökkent (Holcik J. 2003). A jelentős horgász- és halászfogások „veszteségeit” tenyésztésből származó kihelyezésekkel lehetne pótolni (Szabó et al. 2009). Mesterséges szaporítására vonatkozóan igen kevés irodalmi adat áll rendelkezésre, így annak további vizsgálata elengedhetetlen (Bokor et al. 2007). A spermamélyhűtés egyszerűbbé és költséghatékonyabbá teheti a szaporítási és nevelési folyamatokat (Bokor et al. 2019). Ezen felül lehetővé teszi a kiváló minőségű ivarsejtek megőrzését, illetve génbankok létrehozását (Bernáth et al. 2018). A hímivartermék megfelelő minősége elengedhetetlen fontosságú a sikeres mélyhűtés és szaporítás elérése érdekében (Cosson J. 2019). A kősüllő mesterséges termékenyítésével eddig nagyon kevesen foglalkoztak. A faj spermamélyhűtéséről tudomásunk szerint csak egy tanulmányban írnak (Bokor et al. 2007). Kísérletünk célja a kősüllő sperma mélyhűtési technológiák fejlesztése volt, melyek alapjául szolgálnak a tervezett szaporítási vizsgálatoknak.

Anyag és módszer

A kísérleteinkhez a tejes állományt a Balatoni Halgazdálkodási Nonprofit Zrt. biztosította. A vizsgálatokat a Szent István Egyetem, Halgazdálkodási Tanszékének telephelyén található haltartó infrastruktúrájában végeztük. Az oltást megelőzően a halakat 2-fenoxi-etanolt (99%, 0,4 ml/l) tartalmazó vízben bódítottuk. A spermáció indukálásához hipofízis kezelést alkalmaztunk. Az ivarterméket a halak hasfalának felmetszését követően a herék préselésével nyertük ki. A sejtek progresszív motilitását a friss és a mélyhűtött mintákban egyaránt számítógépes spermavizsgáló rendszerrel (CASA, Computer-assisted spermanalysis, Sperm VisionTM v. 3.7.4., Minitube of America, Venture Court Verona, Egyesült Államok) végeztük. A sejtek aktiválásához egy 50 mM NaCl tartalmú, 30 mM Tris-sel pufferelt oldatot használtunk (pH: 8,0±0,2, Bokor et al. 2019), melyhez 0,01 g/ml BSA-t (bovine serum albumin, szarvasmarha szérum albumin) adtunk. Vizsgálataink során a mélyhűtéshez kétféle hígítót alkalmaztunk. Védőanyagként 10% metanolt használtunk. A kísérletek folyamán minden alkalommal 1:9 (sperma:hígító+védőanyag) arányban hígítottuk a spermát. A mintákat 0,25, vagy 0,5 ml-es műszalmába töltöttük. A fagyasztáshoz két különböző mélyhűtési módszert alkalmaztunk. A programozható fagyasztó berendezésben (CRF, Controlled rate freezer, IceCube 14s, IceCube Series v. 2.24, Sy-Lab, Neupurkersdorf, Ausztria) történő mélyhűtés során egy előre megírt program (hűtési sebesség: 56 °C/perc) alapján fagyasztottuk a műszalmákat. A polisztirol dobozban történő mélyhűtés alkalmával 3 cm-en a nitrogén gőzében hűtöttük a mintákat, a folyamat 3 percig tartott (Bokor et al. 2019; Horváth et al. 2003). A sperma felolvasztását 40 °C-os vízfürdőben (ThermoHaake P5, Thermo Electron Corp, Waltham, Massachusetts, Egyesült Államok) végeztük.

Kísérleti terv

Az első kísérlet során 20 hímtől nyert ivarterméket vizsgáltunk. A sperma mintákat 1:1000 hígítási arányban hígítottuk. A sejtszám meghatározáshoz sejtszámláló kamrát (Bürker típus, Neubauer, Marienfield Superior, Paul Marienfield GmBH & CO. KG, Németország) használtunk. Fénymikroszkóp segítségével minden mintáról 20 db képet készítettünk, ezt követően egy Image J nevű programmal (Image J for Windows, National Institutes of Health, Egyesült Államok) számoltuk le a sejteket. A ml-re jutó sejtszámot (N) az alábbi képlet szerint határoztuk meg, ahol X az átlagos sejtszámot jelöli: N=X × 25 × 10 × 1000 × 1000 (Bokor Z. 2009).

Következő vizsgálatunkban a hím (N=4) egyedek heréjének kioperálása során nyert spermát mélyhűtöttük kétféle hígítóval. Az ivarterméket csuka (150 mM glükóz, 75 mM NaCl, 30 mM KCl, 1 mM Na₂HPO₄ × 12H₂O, 1 mM MgCl₂ × 6H₂O, 1 mM CaCl₂ × 2H₂O, 20 mM Tris, és 0,5% BSA, pH: 8±0,2, Molnár et al. 2020) és módosított Tanaka hígító (137 mM NaCl, 76,2 mM NaHCO₃, Bernáth et al. 2015b) felhasználásával 0,5 ml-es műszalmákban mélyhűtöttük polisztirol dobozban. A friss és a mélyhűtött minták felolvasztás utáni motilitását egyaránt rögzítettük.

Utolsó vizsgálatunkban oltást követően 24 órával 5 kősüllő tejes heréjét operáltuk ki és préseltük össze, majd az így nyert sperma motilitását CASA rendszerrel rögzítettük. A módosított Tanaka oldattal kihígított ivarterméket 0,25 ml-es és 0,5 ml-es műszalmákba töltöttük. A mintákat programozható fagyasztó berendezésben mélyhűtöttük. Olvasztást követően rögzítettük a minták motilitását.

Eredmények és következtetések

Első vizsgálatunkban 20 kősüllőtől nyert sperma sejtkoncentrációját állapítottuk meg, ami alapján 1 ml spermában átlagosan 3×10¹⁰ sejt található. Második vizsgálatunkban a friss (40±10%), a módosított Tanaka (41±13%), valamint a csuka (24±6%) hígítóval mélyhűtött minták olvasztás utáni progresszív motilitása között nem találtunk szignifikáns különbséget (1.ábra).

1. ábra Két különböző hígító összehasonlítása során mért progresszív motilitás (N=4). Az ábrán átlagértékek és a hozzájuk tartozó szórások láthatók.

A friss minták (23±19%) és a két különböző méretű műszalma (0,25 ml: 31±6%, 0,5 ml: 27±9%) használatával mélyhűtött minták progresszív motilitása között nem volt szignifikáns különbség (2. ábra).

2. ábra A CRF-ben mélyhűtött 0,25 ml-es és 0,5 ml műszalmák összehasonlítása során mért progresszív motilitás (N=5). Az ábrán átlagértékek és a hozzájuk tartozó szórások láthatók.

A sejtsűrűség meghatározásra kősüllő esetén tudomásunk szerint eddig nem történt vizsgálat, rokon fajoknál azonban igen. A süllő ivartermék sejtkoncentrációját Bokor et al. vizsgálta 2012-ben, ahol 1 ml spermában 8,3×10⁹ sejtszámot határozott meg. Alavi et al. (2007) sügérnél végzett sűrűség meghatározást, 1 ml hímivartermékben 2,9×10¹⁰ spermasejtet állapított meg. Ehhez hasonló a kősüllő sperma sejtszáma, 3×10¹⁰ sejt/ml, melyet vizsgálatunkban mértünk. A korábban más fajoknál eredményesen tesztelt oldatok közül (módosított Tanaka hígító-Bernáth et al. 2015a, Csuka hígító-Molnár et al. 2020), a módosított Tanaka hígító bizonyult a legalkalmasabbnak a kősüllő sperma fagyasztása során. A 0,25 (31±6%) és 0,5 (27±9%) ml-es műszalmák mélyhűtési vizsgálatában az felolvasztást követően nem találtunk szignifikáns különbséget a friss (23±19%) és mélyhűtött minták között. Dietrich 2016-os vizsgálatában 0,25 ml-es műszalmában mélyhűtött csuka sperma felhasználásával 90 %-os termékenyülést ért el, megvizsgálva a friss és mélyhűtött minták motilitását (magasabb mint 60%) szintén nem talált szignifikáns különbséget. Amennyiben korlátozott mennyiségű ivartermék áll rendelkezésre a 0,25 ml-es műszalma, más fajokhoz hasonlóan, a kősüllő sperma mélyhűtésére is hatékonyan alkalmazható.

Összefoglalás

Tudomásunk szerint elsőként határoztuk meg a kősüllő sperma sejtkoncentrációját 20 tejes egyed felhasználásával. A vizsgált hígítók összehasonlítása során a módosított Tanaka bizonyult hatékonyabbnak a kősüllő sperma mélyhűtéséhez. A 0,25 ml-es és 0,5 ml-es műszalmák összehasonlítása során kapott eredmények alapján a két különböző méretű műszalma egyaránt használható kősüllő sperma mélyhűtésre. A polisztirol doboz terepi körülmények között akár közvetlenül a vízparton, a programozható fagyasztó berendezés a keltetőházi szaporítás során teheti lehetővé a kősüllő sperma fagyasztását a közeljövőben.

Kulcsszavak: kősüllő, sejtsűrűség, spermamélyhűtés, CASA

Köszönetnyilvánítás

A kísérletek végrehajtásához a GINOP-2.3.2-15-2016-00004, az Európai Halászati Alap, Halászati Operatív Program III. tengelye (“Európai Halászati Alap: a megújuló halászatért” - az Európai Unió és Magyarország támogatásával), és az EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00008 pályázatok járultak hozzá. A projekt az Európai Unió támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával valósult meg. A kutatás továbbá Bernáth Gergely Bolyai János Kutatási (BO/00508/18/4) Ösztöndíjának és Az Innovációs és Technológiai Minisztérium ÚNKP-19-4 kódszámú Új Nemzeti Kiválóság Programjának szakmai támogatásával készült.

Irodalom

Alavi S.M.H., Rodina M., Policar T., Kozak P., Psenicka M., Linhart O. 2007. Semen of Perca fluviatilis L.: Sperm volume and density, seminal plasma indices and effects of dilution ratio, ions and osmolality on sperm motility. Theriogenology, 68, 276–283.

Bernáth G., Żarski D., Krejszeff S., Palińska‐Żarska K., Bokor Z., Król J., Kollár T., Kucharczyk D., Urbányi B., Horváth Á. 2015a. Optimization of conditions for the cryopreservation of Eurasian perch (Perca fluviatilis Linnaeus, 1758) sperm. Journal of Applied Ichthyology, 94–98.

Bernáth G., Bokor Z., Kása E., Várkonyi L., Hegyi Á., Kollár T., Urbányi B., Zarski D., Ifj. Radóczi J., Horváth Á. 2015b. Comparison of two different methods in the cryopreservation of Eurasian perch (Perca fluviatilis) sperm. Cryobiology, 70, 76–78.

Bernáth G., Csenki Zs., Bokor Z., Várkonyi L., Molnár J., Szabó T., Staszny Á., Ferincz Á., Szabó K., Urbányi B., Pap L.O., Csorbai B. 2018. The effects of different preservation methods on ide (Leuciscus idus) sperm and the longevity of sperm movement. Cryobiology, 81, 125–131.

Bokor Z. 2009. A harcsa (Silurus glanis) és a süllő (Sander lucioperca) sperma mélyhűthetőségének vizsgálata gyakorlati szempontok alapján. Doktori értekezés, SZIE Gödöllő, 102 p.

Bokor Z., Müller T., Bercsényi M., Horváth L., Urbányi B., Horváth Á. 2007. Cryopreservation of sperm of two European percid species, the Pike perch (Sander lucioperca) and the Volga pikeperch (S. volgensis). Acta Biologica Hungarica, 58, 199–207.

Bokor Z., Urbányi B., Horváth L., Müller T., Horváth Á.. 2012. Sperm Cryopreservation of Two European Predator Fish Species, the Pikeperch (Sander lucioperca) and the Wels Catfish (Silurus glanis). In: Katkov, I. (Ed.): Current Frontiers in Cryopreservation. InTech, 462, 253-268.

Bokor Z., Bernáth G., Várkonyi L., Molnár J., Láng L.Z., Tarnai-Király Zs., Solymosi E., Urbányi B. 2019. The applicability of large-scale sperm cryopreservation in wels catfish (Silurus glanis) optimized for hatchery practice. Aquaculture, 506, 337–340.

Cosson J. 2019. Fish sperm physiology: structure, factors regulating motility, and motility evaluation. In: Yusuf B. (Ed.): Biological Research in Aquatic Science, 11–36.

Holcik J. 2003. Changes in the fish fauna and fisheries in the Slovak section of the Danube River: a review. Annales de Limnologie - International Journal of Limnology, 39 (3), 177–195.

Horváth Á., Miskolci E., Urbányi B. 2003. Cryopreservation of common carp sperm. Aquatic Living Resources, 16, 5, 457–460.

Molnár J., Bokor Z., Várkonyi L., Izsák T., Füzes-Solymosi E., Láng Z.L., Csorbai B., Tarnai-Király Zs., Urbányi B., Bernáth G. 2020. The systematic development and optimization of large-scale sperm cryopreservation in northern pike (Esox lucius). Cryobiology, 4–9.

Szabó G., Müller T., Molnár T.G., Sudár G., Zake Z., Hancz Cs. 2009. Különböző takarmányadagok hatása a kősüllő (Sander volgensis Gmelin 1788) növekedésére és testösszetételére intenzív nevelés mellett. Acta Agraria Kaposváriensis, 17 (1), 37–46.

Várkonyi L., Bokor Z., Molnár J., Fodor F., Szári Zs., Ferincz Á., Staszny Á., Láng L.Z., Csorbai B., Urbányi B., Bernáth G. 2019. The comparison of two different extenders for the improvement of large–scale sperm cryopreservation in common carp (Cyprinus carpio). Reproduction in Domestic Animals, 54, 3, 639–645.