A balatoni busaállomány nagyságának és térbeli eloszlásának becslése környezeti DNS (eDNS) módszerrel (előzetes eredmények)

ARDÓ László1, BOROS Gergely2, MOZSÁR Attila1, SZŰCS Anita1, BERECZ Orsolya1, FAZEKAS Gyöngyvér1, JÓZSA Vilmos1, VITÁL Zoltán2, BOROSS Nóra2

1Nemzeti Agrárkutatási és Innovációs Központ, Halászati Kutatóintézet, Szarvas, Anna-liget u. 35. ardo.laszlo[kukac]haki.naik.hu
2
Ökológiai Kutatóközpont, Balatoni Limnológiai Intézet (ÖK-BLI), 8237 Tihany, Klebelsberg Kuno u. 3. boross.nora[kukac]okologia.mta.hu

Kivonat

Bevezetés

A Kelet-Ázsiából származó busafajok (fehér busa (Hypophthalmichthys molitrix); pettyes busa (H. nobilis)) Balatonba való telepítését 1972-ben kezdték el, a halászati hozamok növelése és az akkoriban igen intenzíven jelentkező planktonikus eutrofizáció visszaszorítása céljából. Mivel a busák nem váltották be a hozzájuk fűzött reményeket, így telepítésüket az 1980-as évek elején leállították (Specziár A. 2010). Ennek ellenére napjainkban is jelentős állományuk él a Balatonban, melyet az eddigi morfológiai és genetikai vizsgálatok alapján főként a fehér- és pettyes busa hibridjei alkotnak (Boros és mtsai 2014, Kovács és mtsai. 2016, Mozsár és mtsai. 2017). Ugyanakkor a balatoni busaállomány mennyiségi viszonyaival és térbeli eloszlásával kapcsolatos ismereteink meglehetősen hiányosak. Ennek oka, hogy a Balaton adottságainak köszönhetően (nagy vízfelület, melyhez viszonylag kis átlagos vízmélység párosul) sem a hagyományos halászati módszerekkel, sem pedig hidroakusztikus technikával (szonárral) nem mérhető fel igazán hatékonyan a busák állománya. Ezért egy újszerű megközelítést, az ún. környezeti DNS (environmental DNA, a továbiakban eDNS) analízist alkalmaztuk, melynek segítségével reményeink szerint az eddiginél pontosabb képet kaphatunk a balatoni busaállomány méretéről és eloszlásáról.

Az eDNS olyan DNS, amelyet nem az élőlényekből, hanem azok környezetéből (pl. vízből vagy talajból) izolálnak (Thomsen P.F. és Willerslev E. 2015). Az elválasztásra megfelelnek a hagyományos DNS-izoláló módszerek. Egy adott faj jelenléte az eDNS-sel végzett polimeráz láncreakcióval (polymerase chain reaction, PCR) mutatható ki, amelyhez a fajra tervezett specifikus oligonukleotid primereket kell használni. Az utóbbi években a valós idejű kvantitatív polimeráz láncreakció (real-time quantitative PCR, a továbbiakban qPCR) technikájának kifejlesztése és elterjedése lehetővé tette, hogy ne csak a faj jelenlétét tudjuk kimutatni, de a biomasszájának nagyságát is meg tudjuk becsülni. Ehhez a két primeren kívül szükség van egy harmadik oligonukleotidra is. Ez a próba, amely szintén az adott fajra specifikus. A próba egy fluoreszcens festékkel jelölt, amely a PCR reakció során leválik, és egy adott hullámhosszon fluoreszkálni kezd. Ezt a fluoreszcenciát egy qPCR készülékkel a reakció futása alatt folyamatosan, valós időben detektálni lehet (Shipley G.L. 2006). A fluoreszcencia fokozatosan erősödik a reakció előrehaladtával, de az intenzitása függ a kiinduló DNS (templát) mennyiségétől is. Minél több volt a mintában az adott fajra specifikus DNS, a fluoreszcencia annál hamarabb ér el egy küszöbértéket. Az ehhez szükséges idő a küszöbciklus (treshold cycle, Ct). A fajra jellemző eDNS mennyiségi meghatározásához standard sort kell készíteni, majd az ismert koncentrációkhoz tartozó Ct értékekből standard görbét kell felvenni. Erről a görbéről lehet leolvasni a minták Ct értékéhez tartozó eDNS mennyiségét.

A fentiek alapján ez a módszer jól használható egy adott halfaj biomasszájának becslésére egy vízterületen (Takahara és mtsai. 2012). Különböző pontokról gyűjtött minták elemzésével a populáció térbeli eloszlását is meg tudjuk becsülni. Eredetileg újonnan megjelent invazív vagy veszélyeztetett őshonos fajok jelenlétének detektálására és állománybecslésére fejlesztették ki (Thomsen és mtsai. 2012, Farrington és mtsai. 2015), mivel a módszer rendkívül érzékeny, nagyon kis mennyiségű DNS-t is ki tud mutatni (Hunter és mtsai. 2017), de alkalmazható nagyobb populációk biomasszájának becslésére is. A módszer használata során nem szükséges a halfaj egyedeinek kifogása, amely ráadásul nem is valósítható meg más halfajok kifogása vagy zavarása nélkül. A balatoni GINOP projektben (GINOP-2.3.2-15-2016-00004) a Balatonban élő busaállomány nagyságának és térbeli eloszlásának becslésére használtuk.


Anyag és módszer

2018 májusában 70 mintavételi helyen (lásd 1. ábra), összesen 280 vízmintát gyűjtöttünk a Balatonból. Az egyes helyeken YSI szonda segítségével rögzítettünk háttérváltozókat, valamint a pontos GPS koordinátákat. Mintavételi helyenként négyszer 50ml vizet vettünk steril centrifugacsövekbe, amelyeket ezután jégen tároltunk. A helyek között az eszközöket fertőtlenítettük, gumikesztyűt cseréltünk. Mintavételi kontrollként a laboratóriumból a helyszínre vitt desztillált vizet használtuk. A terepi mintavételt több napnyi nyugodt, szélcsendes időjárást követően végeztük, mivel a felkeveredő üledék befolyásolhatja a kimért DNS mennyiségét. A Balaton vizének Secchi-átlátszósága átlagosan 138 cm volt, amely jól mutatja a felkeveredettség hiányát. A vízmintákat 12 órán belül -20 °C hőmérsékleten lefagyasztottuk, és fagyott állapotban a NAIK Halászati Kutatóintézetbe szállítottuk. A vízmintákból E.Z.N.A. Tissue DNA Kit (Omega Bio-Tek, USA) használatával kivontuk a DNS-t, amelyet további felhasználásig -20 °C-os hőmérsékleten tároltunk. Az eDNS mennyiségi meghatározásához szükséges qPCR reakciókat minden minta esetében három párhuzamossal futtattuk. A reakciókba a minta és a mindkét busafajra specifikus primerek és próba mellett egy szintetikus belső pozitív kontroll (internal positive control, IPC) szekvenciát is belemértünk, a rá specifikus primerekkel és próbával együtt (Farrington és mtsai. 2015, Hunter és mtsai. 2017). Ez a fals negatívok (nem működő reakciók) kiszűrésére szolgált, amit az tett lehetővé, hogy a busákra és az IPC-re specifikus próbákat jelölő festékek (FAM és HEX) eltérő hullámhosszú fényt bocsájtanak ki. Pozitív kontrollként busa uszonymintából kivont DNS-t, negatív kontrollként nukleázmentes vizet használtunk. Minden futtatáshoz külön standard sort állítottunk össze, így egy futtatás során 24 minta tesztelésére volt lehetőség. A standard egy mesterségesen előállított DNS-szakasz volt, amelynek nukleotidsorrendje megegyezett a két busafajra jellemző célszekvenciával. A standard görbe alapján kiszámítottuk a busa DNS kópiaszámát a 20 µl térfogatú reakciókban (ha a minta pozitív volt). Az egy helyen vett minták átlagából számoltuk ki busa DNS koncentrációját az adott mintavételi helyen (kópia/liter).


Eredmények és következtetések

A 70 mintavételi hely közül 53 helyen kaptunk pozitív eredményt. Az összesen 248 értékelhető mintából 150 volt negatív, 98 pozitív. A medencénkénti átlagos kópiaszám/liter értékek nyugatról keletre haladva: Keszthelyi medence: 1535; Szigligeti medence: 659; Szemesi medence: 1711; Siófoki medence:1844.

1.ábra A Balaton egyes mintavételi helyein mért busa DNS kópiaszám/liter értékek térképes megjelenítése.

Környezeti DNS analízis eredményeinek segítségével készíthettünk egy eloszlási térképet a balatoni busaállomány adott időben való elterjedéséről. Bár azt várjuk, hogy a busák vándorolnak, egy Balaton méretű tó esetében nem korlátozódik életterük egy medencére, mégis egy ilyen vizsgálat során megmutatkozhatnak preferált területek. Esetünkben a Siófoki medencében, valamint a Tihanyi szoros közelében kaptuk a legnagyobb arányú kópiaszámot. Ezeket a területeket nagyobb vízmélység jellemzi, mely a nyílt vízi régióban rajokban úszó busa számára előnyös tulajdonság lehet. A tó teljes területén kimutattuk a busák jelenlétét, amelyet - figyelembe véve a nyugodt időjárási viszonyokat és a környezeti DNS lebomlási idejét - a busák tényleges előfordulása okozott, és nem a víz medencék közötti áramlása.

Ahhoz, hogy a vízből kimutatott DNS mennyiségéből a busaállomány nagyságára a kópiaszámokból megbízhatóan következtetni tudjunk, figyelembe kell venni, hogy adott méretű hal milyen sebességgel adja le a DNS-t a környezetébe. A hal biomassza nagyléptékben egyenesen arányos a leadás mértékével, és ez fajra specifikus (Klymus és mtsai. 2015). Ugyanakkor azt is számításba kell venni, hogy milyen gyorsan bomlik le a DNS az adott víztestben, melyet több tényező is befolyásol: vízhőmérséklet, pH, lebontó szervezetek stb. (Lance és mtsai. 2017). A továbbiakban azon dolgozunk, hogy a lehető legpontosabb becslést adhassuk a balatoni busaállomány nagyságáról az előbbiek figyelembevételével, a kapott DNS kópiaszámok alapján.


Kulcsszavak: busa, Balaton, biomassza, környezeti DNS


Köszönetnyilvánítás

Köszönetet szeretnénk mondani a US Geological Survey, Columbia Environmental Research Center kollégáinak, Duane C. Chapmannek, Cathy A. Richternek, Katy E. Klymusnak és Nathan Thompsonnak a szakmai tanácsaikért és módszertani útmutatásukért. Kern Bernadettnek köszönjük a terepi munkában való részvételét. A kutatás anyagi támogatását a GINOP-2.3.2-15-2016-00004 pályázat biztosította.


Irodalom

Boros G., Mozsár A., Vitál Z., Nagy A.S., Specziár A. 2014. Growth and condition factor of hybrid (Bighead Hypophthalmichthys nobilis Richardson, 1945 x silver carp H. molitrix Valenciennes 1944) Asian carps in the shallow, oligo-mesotropic lake Balaton. Journal of Applied Ichthyology 30, 546-548.

Farrington H.L., Edwards C.E., Guan X., Carr M.R., Baerwaldt K., Lance R.F. 2015. Mitochondrial genome sequencing and development of genetic markers for the detection of DNA of invasive bighead and silver carp (Hypophthalmichthys molitrix and H. nobilis) in environmental water samples from the United States. PLoS ONE 10(2) https://doi.org/10.1371/journal.pone.0117803

Hunter M.E., Dorazio R.M., Butterfield J.S.S., Meigs-Friend G., Nico L.G., Ferrante J.A. 2017. Detection limits of quantitative and digital PCR assays and their influence in presence-absence surveys of environmental DNA. Molecular Ecology Resources 17(2), 221-229.

Klymus K.E., Richter C.A., Chapman D.C., Paukert C. 2015. Quantification of eDNA shedding rates from invasive bighead carp Hypophthalmichthys nobilis and silver carp Hypophthalmichthys molitrix. Biological Conservation, 183, 77-84.

Kovács B., Boros G., Vitál Z., Mozsár A., Specziár A., Józsa V., Urbányi B., Lehoczky I. 2016. Genetic analysis of filter feeding Asian carps (Hypophthalmichthys spp.) in Lake Balaton, Hungary. Aquaculture Europe 2016, 67-67.

Lance R.F., Klymus K.E., Richter C.A., Guan X., Farrington H.L., Carr M.R., Thompson N., Chapman D.C., Baerwaldt K.L. 2017. Experimental observations on the decay of environmental DNA from bighead and silver carps. Management of Biological Invasions, 8(3), 343.

Mozsár A., Specziár A., Battonyai I., Borics G., Görgényi J., Horváth H., Présing M., G-Tóth L., Vitál Z., Boros G. 2017. Influence of environmental factors and individual traits on the diet of non-native hybrid bigheaded carp (Hypophthalmichthys molitrix x H. nobilis) in Lake Balaton, Hungary. Hydrobiologia 794(1), 317-332.

Shipley G.L. 2006. An introduction to real-time PCR. M. Tevfik Dorak (ed.): Real-time PCR. Taylor-Francis London and New York, 1-29.

Specziár A. 2010. A Balaton halfaunája: A halállomány összetétele, az egyes halfajok életkörülményei és a halállomány korszerű hasznosításának feltételrendszere. Acta Biol. Debr. Oecol. Hung. 23. Debrecen, Debreceni Egyetem, 185 p.

Takahara T., Minamoto T., Yamanaka H., Doi H., Kawabata Z. 2012. Estimation of fish biomass using environmental DNA. PLoS ONE 7(4) https://doi.org/10.1371/journal.pone.0056584

Thomsen P.F., Kielgast J., Iversen L.I., Wiuf C., Rasmussen M., Gilbert M.T.P., Orlando L., Willerslev E. 2012. Monitoring endangered freshwater biodiversity using environmental DNA. Molecular Ecology 21, 2565-2573.

Thomsen P.F., Willerlev E. 2015. Environmental DNA – An emerging tool in conservation for monitoring past and present biodiversity. Biological conservation 183, 4-18.

Programajánló

Jelenleg nincs aktuális esemény.