MAGYAR ÉS LENGYEL KECSKERÁK (ASTACUS LEPTODACTYLUS) POPULÁCIÓK ÖSSZEHASONLÍTÓ GENETIKAI VIZSGÁLATA
Fazekas Gyöngyvér1, Farkas Móni1, Kovács Balázs2, Józsa Vilmos1
1Nemzeti Agrárkutatási és Innovációs Központ, Halászati Kutatóintézet, Szarvas, Anna-liget u. 35. fazekas.gyongyver[kukac]haki.naik.hu
2Szent István Egyetem, Halgazdálkodási Tanszék, Gödöllő, Páter Károly u.1.
Kivonat
Bevezetés
A természetvédelmi oltalom alatt álló tízlábú rákfajok, köztük a kecskerák (Astacus leptodactylus), számára megfelelő életkörülményeket biztosító területek száma folyamatosan csökken Magyarországon. Ennek fő oka az élőhelyeik időszakos szennyezése és az inváziós fajok agresszív térhódítása (Kovács et al. 2015). A védelmükhöz szükséges megfelelő óvintézkedéshez és stratégia kidolgozásához elengedhetetlen élőhelyeik állapotának pontos felmérése, az idegenhonos fajok rájuk gyakorolt hatásának ismerete, kiegészítve az állományok genetikai állapotának vizsgálatával. A 2017-ben indult országos rák monitor program keretében végeztük el egy magyarországi kecskerák populáció genetikai diverzitásának vizsgálatát. A hazai populáció genetikai hátterét egy Lengyelországból származó populáció mintáival hasonlítottuk össze.
Anyag és módszertan
Összesen 78 kecskerák mintát vizsgáltunk meg, amelyből 48 hazai, 30 külföldi (Lengyelország) eredetű volt. Az első pár járóláb izom szövetéből nyertük ki a DNS-t az E.Z.N.A. Insect DNA (Omega Bio-Tek, USA) izoláló készletével, a gyártói protokollt követve. A vizsgálni kívánt DNS koncentrációja 100 és 300 ng/ul között változott. Az állományok genetikai variabilitásának jellemzésére szakirodalmi adatok alapján választottuk ki a markereket, 6 db genomi DNS alapú tetranukleotid tandem ismétlésű mikroszatellit markert használtunk multiplex PCR reakcióban (Gross et al. 2017). A reakciók összeállításánál a Multiplex PCR Plus Kit (QUIAGEN, Germany) gyártói ajánlását követtük. A megfelelő mérettartományú markerekből egy triplex és két duplexből álló multiplex PCR reakciót hoztunk létre. A szetteket három különböző fluoreszcens festékkel jelöltük, melyek így a fragmentanalízis során egyszerre vizsgálhatóak voltak. A szettek összeállítását az 1. táblázat tartalmazza.
|
Primer neve |
Fluoreszcens |
Primer |
Allélok száma |
Allélok |
Génbanki azonosító |
Multiplex I. |
Aast4_30 |
NED |
0,2 |
3 |
145-155 |
KU955563 |
Multiplex II. |
Aast4_16 |
VIC |
0,2 |
10 |
162-184 |
KU955549 |
Multiplex III. |
Aast4_2 |
PET |
0,2 |
15 |
152-198 |
KU955535 |
* Az allélok csak a magyar populációban voltak olvashatóak.
A lókuszokat egy touchdown PCR reakció során sokszoroztuk fel. A ciklus beállításai a következők voltak: kezdeti denaturáció 95°C-on 5 perc, melyet 20 ciklus követett 95°C-on 30 másodpercig, 60-50 °C feltapadási hőmérséklet (ciklusonként 0,5°C-kal csökkent) 90 másodpercig és 72°C-on 30 másodpercig. A következő 10 ciklusban: 95°C-on 30 másodpercig, 50°C feltapadási hőmérséklet 90 másodpercig, 72°C-on 30 másodpercig, a majd a végső lánc hosszabbítás 60°C-on 30 másodpercig tartott. Az így felsokszorozott termékekből a fragmentumok méretét a Genetic Analyser 3130 (Applied Biosystems) kapilláris elektroforézis készülékkel határoztuk meg. A kromatogramok kiértékeléséhez az allélok számának és méretének meghatározásához a GeneMapper 4.0 (Applied Biosystems) programot használtuk. A genetikai elemzéshez, az allélgyakoriságokat, a megfigyelt és várt heterozigozitást, a fixációs indexet és a genetikai strukturálódást a GenAlEx 6.51 (Peakall, Smouse 2012) program segítségével végeztük el.
Eredmények és következtetések
A vizsgálatok során mind a hét mikroszatellit marker polimorf mintázatot adott, azonban az egyik marker (Aast4_26) csak a magyar mintáknál működött, ezért ennek a lókusznak az adatait kihagytuk az elemzésből. A hat markerrel összesen 42 allélt mutattunk ki. A lókuszonkénti allélszám 2 és 15 között változott, egy marker (Aast4_48) esetében azonban monomorf mintázatot kaptunk a lengyel állományban. A magyar populációban 25, a lengyelben 29 allélt detektáltunk összesen. A vizsgált állományok genetikai variabilitásának, illetve az allélikus mintázat statisztikai vizsgálatát, először lókuszonként hajtottuk végre (2. táblázat), majd a populációnkénti átlagokat számoltuk ki (3. táblázat). A vizsgált paraméterek a következők voltak: értékelhető genotípusok száma, allél szám, megfigyelt és várt heterozigozitás mértéke, lókuszonként Hardy-Weinberg populációs egyensúlyi állapottól való eltérés mértékét és a fixációs index. A populációk átlagos várt (He) és mért (Ho) heterozigozitás értékei 0,38 és 0,53 között változtak. A magyar csoportban a két érték közel állt egymáshoz 0,51 (He), 0,53 (Ho), a lengyel csoportban a mért heterozigozitás értéke nagyobb volt a várt értéknél, azonban a hat lókusz közül, mindössze egynél tapasztaltunk szignifikáns eltérést a HWE-egyensúlytól, míg a magyar állományban három marker esetében is eltérés volt megfigyelhető. A heterozigóták arányából számított fixációs indexek (F) átlag értéke mindkét populáció esetében negatív volt, amely heterozigóta túlsúlyra utal. A fixációs indexek és a HWE-tesztek összesített eredményei is arra utalnak, hogy a magyar populáció egyedei pánmiktikus szaporodási közösséget alkotnak, egyensúlyban vannak. Azonban a fixációs index értéke alapján, a lengyel populációban kisebb mértékű keveredés, beáramlás feltételezhető egy másik populációból.
Populáció |
Lókuszok |
N |
Na |
Ho |
He |
S |
F |
Magyar |
Aast4_32 |
48 |
2 |
0,63 |
0,43 |
** |
-0,45 |
|
Aast4_16 |
44 |
4 |
0,57 |
0,5 |
ns |
-0,13 |
|
Aast4_30 |
48 |
2 |
0,58 |
0,49 |
ns |
-0,19 |
|
Aast4_48 |
48 |
3 |
0,48 |
0,46 |
ns |
-0,05 |
|
Aast4_20 |
45 |
4 |
0,42 |
0,61 |
*** |
0,31 |
|
Aast4_2 |
47 |
10 |
0,4 |
0,69 |
*** |
0,42 |
Lengyel |
Aast4_32 |
30 |
2 |
0,97 |
0,5 |
*** |
-0,94 |
|
Aast4_16 |
24 |
8 |
0,42 |
0,37 |
ns |
-0,14 |
|
Aast4_30 |
30 |
2 |
0,13 |
0,12 |
ns |
-0,07 |
|
Aast4_48 |
30 |
1 |
monomorf |
monomorf |
|
|
|
Aast4_20 |
26 |
5 |
0,46 |
0,44 |
ns |
-0,05 |
|
Aast4_2 |
29 |
11 |
0,76 |
0,83 |
ns |
0,09 |
Értékelhető minták száma (N), Allélok száma (Na), Megfigyelt (Ho), és Várt heterozigócia (He), Hardy-Weinberg-egyensúlyi állapottól való eltérés szignifikancia szintje (S) ns=nem szignifikáns * P <0.05. ** P<0.01. *** P<0.001 Fixációs index (F)
Populáció |
N |
Na |
Ho |
He |
F |
Magyar |
46,6 |
4 |
0,51 |
0,53 |
-0,02 |
Lengyel |
28,1 |
5 |
0,46 |
0,38 |
-0,22 |
Értékelhető minták száma (N), Allélok száma (Na), Megfigyelt (Ho), és Várt heterozigócia (He) Fixációs index (F)
Az allélfrekvencia adatokat alapul véve GeneAlEx program „Population Assignment” tesztjével elvégeztük az egyedek populációhoz sorolását is. Az alkalmazott program a csoportokhoz rendelt egy arra jellemző genetikai profilt és az egyedek genetikai jellegéből számított érték alapján besorolta (származtatta) a legvalószínűbb csoportba. A magyar csoport egyedeit 100 %-ban, a lengyel csoport egyedeit 99%-ban helyesen sorolta be a megfelelő populációba. Az egyedekhez tartozó értékek grafikus megjelenítése mutatja a két populáció genetikai strukturálódását. A vizsgált magyar és lengyel populációk egymástól teljesen elkülönültek, a populációkon belül nem tapasztalható strukturálódás (szubpopulációk), melyből arra következtethetünk, hogy nincs jelentős mértékű izoláció és génáramlás (1. ábra), azonban a lengyel állomány esetén, néhány egyed kilóg a populációból, ami alátámasztja a feltételezett génáramlást.
Összefoglalás
Eredményeink alapján elmondhatjuk, hogy a magyar állomány gazdag genetikai változatossággal rendelkezik, nem fenyegeti genetikai beszűkülés, és izolációra utaló jeleket sem találtunk. A vizsgált populáció genetikai struktúrája, nem reprezentálja ugyan a teljes hazai kecskerák populációt, de jó kiindulási alapot szolgáltat a további genetikai vizsgálatokhoz. A két populáció genetikai gazdagsága hasonlónak mondható, a detektált allélok számában nem volt nagy különbség, a magyar populációban magasabb volt a heterozigóták aránya a lengyel csoporttal szemben. A vizsgált markerekkel genetikailag jól elkülöníthető volt a két populáció.
Kulcsszavak: kecskerák, magyar, lengyel, mikroszatellit, multiplex PCR, genetikai analízis
Köszönetnyilvánítás
Kutatásunkat a Földművelésügyi Minisztérium Halgazdálkodási Alapja (HHgF/248/2017. számú támogatási szerződése) támogatta.
A publikáció az EFOP-3.6.1-16-2016-00016 azonosítószámú, SZIE Szarvasi Campusának kutatási és képzési profiljának specializálása intelligens szakosodással: mezőgazdasági vízgazdálkodás, hidrokultúrás növénytermesztés, alternatív szántóföldi növénytermesztés, ehhez kapcsolódó precíziós gépkezelés fejlesztése című projekt keretében jött létre.
Irodalom
Gross R, Palm S, Köiv K, Pukk L, Kaldre K, 2017. Development and characterization of novel tetranucleotide microsatellite markers in the noble crayfish (Astacus astacus) suitable for highly multiplex and for detecting hybrids between the noble crayfish and narrow-clawed crayfish (A. leptodactylus) Aquaculture 472: 50-56
Kovács K, Nagy P.T, Mayer R, 2015. Adatok a tízlábú rákok (Decapoda: Astacidae, Cambaridae) Északnyugat-magyarországi előfordulásához. Egy Procambarus faj első előkerülése természetes élőhelyéről Magyarországon Acta Biol. Debr. Oecol. Hung. 33: 177-186
Peakall R. and Smouse P. E. 2012. GenAlEx 6.5: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research—an update Bioinformatics, 28: pp. 2537-253
Programajánló
Hírek
Tisztelt Látogatók!
A hazai agrár-felsőoktatás szükséges megújulásának mérföldköve az alapítványi fenntartású Magyar Agrár- és Élettudományi Egyetem (MATE) létrejötte, amely 2021. február 1-től 5 campuson, több mint 13 ezer hallgató számára fogja össze a dunántúli és közép-magyarországi élettudományi és kapcsolódó képzéseket. Az intézményhez csatlakozik a Nemzeti Agrárkutatási és Innovációs Központ (NAIK) 11 kutatóintézete is, így az új intézmény nem csupán egy oktatási intézmény lesz, hanem az ágazat szellemi, szakpolitikai és innovációs központjává válik, amely nagyobb mozgásteret biztosít a képzések, a gazdálkodás és szervezet modernizálásához, fejlesztéséhez. Az összeolvadással magasabb fokozatra kapcsolunk, a kutatói és egyetemi szféra szorosabban fonódik majd össze, aminek következtében még több érdekes, izgalmas kutatás-fejlesztés születhet majd az agrárium területén.
Kérjük, kövesse tevékenységünket a jövőben is a www.uni-mate.hu honlapon!
A szokásostól eltérően az idei évben ősszel, október 03-04 között került megrendezésre az Ultrabalaton csapatversenye. NAIK-os csapat az idei évben állt először rajthoz a 14. alkalommal kiírt versenyen.