MAGYAR ÉS LENGYEL KECSKERÁK (ASTACUS LEPTODACTYLUS) POPULÁCIÓK ÖSSZEHASONLÍTÓ GENETIKAI VIZSGÁLATA

Fazekas Gyöngyvér1, Farkas Móni1, Kovács Balázs2, Józsa Vilmos1

1Nemzeti Agrárkutatási és Innovációs Központ, Halászati Kutatóintézet, Szarvas, Anna-liget u. 35. fazekas.gyongyver[kukac]haki.naik.hu
2Szent István Egyetem, Halgazdálkodási Tanszék, Gödöllő, Páter Károly u.1.

Kivonat

Bevezetés

A természetvédelmi oltalom alatt álló tízlábú rákfajok, köztük a kecskerák (Astacus leptodactylus), számára megfelelő életkörülményeket biztosító területek száma folyamatosan csökken Magyarországon. Ennek fő oka az élőhelyeik időszakos szennyezése és az inváziós fajok agresszív térhódítása (Kovács et al. 2015). A védelmükhöz szükséges megfelelő óvintézkedéshez és stratégia kidolgozásához elengedhetetlen élőhelyeik állapotának pontos felmérése, az idegenhonos fajok rájuk gyakorolt hatásának ismerete, kiegészítve az állományok genetikai állapotának vizsgálatával. A 2017-ben indult országos rák monitor program keretében végeztük el egy magyarországi kecskerák populáció genetikai diverzitásának vizsgálatát. A hazai populáció genetikai hátterét egy Lengyelországból származó populáció mintáival hasonlítottuk össze.


Anyag és módszertan

Összesen 78 kecskerák mintát vizsgáltunk meg, amelyből 48 hazai, 30 külföldi (Lengyelország) eredetű volt. Az első pár járóláb izom szövetéből nyertük ki a DNS-t az E.Z.N.A. Insect DNA (Omega Bio-Tek, USA) izoláló készletével, a gyártói protokollt követve. A vizsgálni kívánt DNS koncentrációja 100 és 300 ng/ul között változott. Az állományok genetikai variabilitásának jellemzésére szakirodalmi adatok alapján választottuk ki a markereket, 6 db genomi DNS alapú tetranukleotid tandem ismétlésű mikroszatellit markert használtunk multiplex PCR reakcióban (Gross et al. 2017). A reakciók összeállításánál a Multiplex PCR Plus Kit (QUIAGEN, Germany) gyártói ajánlását követtük. A megfelelő mérettartományú markerekből egy triplex és két duplexből álló multiplex PCR reakciót hoztunk létre. A szetteket három különböző fluoreszcens festékkel jelöltük, melyek így a fragmentanalízis során egyszerre vizsgálhatóak voltak. A szettek összeállítását az 1. táblázat tartalmazza.


1. táblázat: A multiplex szettek, és a tetranukleotid mikroszatellit lókuszok adatai

 

Primer neve

Fluoreszcens
jelölés

Primer
koncentráció
(µM)

Allélok száma

Allélok
mérete

Génbanki azonosító

Multiplex I.

Aast4_30
Aast4_32
Aast4_48

NED

0,2

3
2
3

145-155
224-236
286-298

KU955563
KU955565
KU955581

Multiplex II.

Aast4_16
Aast4_26

VIC

0,2

10
 (4) *

162-184
251-263

KU955549
KU955559

Multiplex III.

Aast4_2
Aast4_20

PET

0,2

15
9

152-198
202-272

KU955535
KU955553

* Az allélok csak a magyar populációban voltak olvashatóak.

A lókuszokat egy touchdown PCR reakció során sokszoroztuk fel. A ciklus beállításai a következők voltak: kezdeti denaturáció 95°C-on 5 perc, melyet 20 ciklus követett 95°C-on 30 másodpercig, 60-50 °C feltapadási hőmérséklet (ciklusonként 0,5°C-kal csökkent) 90 másodpercig és 72°C-on 30 másodpercig. A következő 10 ciklusban: 95°C-on 30 másodpercig, 50°C feltapadási hőmérséklet 90 másodpercig, 72°C-on 30 másodpercig, a majd a végső lánc hosszabbítás 60°C-on 30 másodpercig tartott. Az így felsokszorozott termékekből a fragmentumok méretét a Genetic Analyser 3130 (Applied Biosystems) kapilláris elektroforézis készülékkel határoztuk meg. A kromatogramok kiértékeléséhez az allélok számának és méretének meghatározásához a GeneMapper 4.0 (Applied Biosystems) programot használtuk. A genetikai elemzéshez, az allélgyakoriságokat, a megfigyelt és várt heterozigozitást, a fixációs indexet és a genetikai strukturálódást a GenAlEx 6.51 (Peakall, Smouse 2012) program segítségével végeztük el.


Eredmények és következtetések

A vizsgálatok során mind a hét mikroszatellit marker polimorf mintázatot adott, azonban az egyik marker (Aast4_26) csak a magyar mintáknál működött, ezért ennek a lókusznak az adatait kihagytuk az elemzésből. A hat markerrel összesen 42 allélt mutattunk ki. A lókuszonkénti allélszám 2 és 15 között változott, egy marker (Aast4_48) esetében azonban monomorf mintázatot kaptunk a lengyel állományban. A magyar populációban 25, a lengyelben 29 allélt detektáltunk összesen. A vizsgált állományok genetikai variabilitásának, illetve az allélikus mintázat statisztikai vizsgálatát, először lókuszonként hajtottuk végre (2. táblázat), majd a populációnkénti átlagokat számoltuk ki (3. táblázat). A vizsgált paraméterek a következők voltak: értékelhető genotípusok száma, allél szám, megfigyelt és várt heterozigozitás mértéke, lókuszonként Hardy-Weinberg populációs egyensúlyi állapottól való eltérés mértékét és a fixációs index. A populációk átlagos várt (He) és mért (Ho) heterozigozitás értékei 0,38 és 0,53 között változtak. A magyar csoportban a két érték közel állt egymáshoz 0,51 (He), 0,53 (Ho), a lengyel csoportban a mért heterozigozitás értéke nagyobb volt a várt értéknél, azonban a hat lókusz közül, mindössze egynél tapasztaltunk szignifikáns eltérést a HWE-egyensúlytól, míg a magyar állományban három marker esetében is eltérés volt megfigyelhető. A heterozigóták arányából számított fixációs indexek (F) átlag értéke mindkét populáció esetében negatív volt, amely heterozigóta túlsúlyra utal. A fixációs indexek és a HWE-tesztek összesített eredményei is arra utalnak, hogy a magyar populáció egyedei pánmiktikus szaporodási közösséget alkotnak, egyensúlyban vannak. Azonban a fixációs index értéke alapján, a lengyel populációban kisebb mértékű keveredés, beáramlás feltételezhető egy másik populációból.


2. táblázat: A genetikai variabilitás és az allélikus mintázat adatai lókuszonként a magyar és lengyel populációkban

Populáció

Lókuszok

N

Na

Ho

He

S

F

Magyar

Aast4_32

48

2

0,63

0,43

**

-0,45

 

Aast4_16

44

4

0,57

0,5

ns

-0,13

 

Aast4_30

48

2

0,58

0,49

ns

-0,19

 

Aast4_48

48

3

0,48

0,46

ns

-0,05

 

Aast4_20

45

4

0,42

0,61

***

0,31

 

Aast4_2

47

10

0,4

0,69

***

0,42

Lengyel

Aast4_32

30

2

0,97

0,5

***

-0,94

 

Aast4_16

24

8

0,42

0,37

ns

-0,14

 

Aast4_30

30

2

0,13

0,12

ns

-0,07

 

Aast4_48

30

1

monomorf

monomorf

 

 

 

Aast4_20

26

5

0,46

0,44

ns

-0,05

 

Aast4_2

29

11

0,76

0,83

ns

0,09

Értékelhető minták száma (N), Allélok száma (Na), Megfigyelt (Ho), és Várt heterozigócia (He), Hardy-Weinberg-egyensúlyi állapottól való eltérés szignifikancia szintje (S) ns=nem szignifikáns * P <0.05. ** P<0.01. *** P<0.001 Fixációs index (F)


3. táblázat: A genetikai variabilitás és az allélikus mintázat átlag értékei a magyar és lengyel populációkban

Populáció

N

Na

Ho

He

F

Magyar

46,6

4

0,51

0,53

-0,02

Lengyel

28,1

5

0,46

0,38

-0,22

Értékelhető minták száma (N), Allélok száma (Na), Megfigyelt (Ho), és Várt heterozigócia (He) Fixációs index (F)

Az allélfrekvencia adatokat alapul véve GeneAlEx program „Population Assignment” tesztjével elvégeztük az egyedek populációhoz sorolását is. Az alkalmazott program a csoportokhoz rendelt egy arra jellemző genetikai profilt és az egyedek genetikai jellegéből számított érték alapján besorolta (származtatta) a legvalószínűbb csoportba. A magyar csoport egyedeit 100 %-ban, a lengyel csoport egyedeit 99%-ban helyesen sorolta be a megfelelő populációba. Az egyedekhez tartozó értékek grafikus megjelenítése mutatja a két populáció genetikai strukturálódását. A vizsgált magyar és lengyel populációk egymástól teljesen elkülönültek, a populációkon belül nem tapasztalható strukturálódás (szubpopulációk), melyből arra következtethetünk, hogy nincs jelentős mértékű izoláció és génáramlás (1. ábra), azonban a lengyel állomány esetén, néhány egyed kilóg a populációból, ami alátámasztja a feltételezett génáramlást.

1. ábra: A magyar és lengyel populációk genetikai strukturálódása


Összefoglalás

Eredményeink alapján elmondhatjuk, hogy a magyar állomány gazdag genetikai változatossággal rendelkezik, nem fenyegeti genetikai beszűkülés, és izolációra utaló jeleket sem találtunk. A vizsgált populáció genetikai struktúrája, nem reprezentálja ugyan a teljes hazai kecskerák populációt, de jó kiindulási alapot szolgáltat a további genetikai vizsgálatokhoz. A két populáció genetikai gazdagsága hasonlónak mondható, a detektált allélok számában nem volt nagy különbség, a magyar populációban magasabb volt a heterozigóták aránya a lengyel csoporttal szemben. A vizsgált markerekkel genetikailag jól elkülöníthető volt a két populáció.


Kulcsszavak: kecskerák, magyar, lengyel, mikroszatellit, multiplex PCR, genetikai analízis


Köszönetnyilvánítás

Kutatásunkat a Földművelésügyi Minisztérium Halgazdálkodási Alapja (HHgF/248/2017. számú támogatási szerződése) támogatta.

A publikáció az EFOP-3.6.1-16-2016-00016 azonosítószámú, SZIE Szarvasi Campusának kutatási és képzési profiljának specializálása intelligens szakosodással: mezőgazdasági vízgazdálkodás, hidrokultúrás növénytermesztés, alternatív szántóföldi növénytermesztés, ehhez kapcsolódó precíziós gépkezelés fejlesztése című projekt keretében jött létre.


Irodalom

Gross R, Palm S, Köiv K, Pukk L, Kaldre K, 2017. Development and characterization of novel tetranucleotide microsatellite markers in the noble crayfish (Astacus astacus) suitable for highly multiplex and for detecting hybrids between the noble crayfish and narrow-clawed crayfish (A. leptodactylus) Aquaculture 472: 50-56

Kovács K, Nagy P.T, Mayer R, 2015. Adatok a tízlábú rákok (Decapoda: Astacidae, Cambaridae) Északnyugat-magyarországi előfordulásához. Egy Procambarus faj első előkerülése természetes élőhelyéről Magyarországon Acta Biol. Debr. Oecol. Hung. 33: 177-186

Peakall R. and Smouse P. E. 2012. GenAlEx 6.5: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research—an update Bioinformatics, 28: pp. 2537-253

Programajánló

Jelenleg nincs aktuális esemény.